igem-2015实验总纲

材料：

菌株：保加利亚乳杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、哈氏弧菌BB152、MC1061（待买）

质粒：PNZ8148、PHY300PLK、PBBR1MCS-5、PNZ9530（是否购买看实验结果）

一：

基因克隆

A：多一个碱基→初步采用SOE-PCR解决

B：正常

C：正常（中间含一段碱基序列，但未造成移码）

D：多一个碱基→初步采用SOE-PCR解决

R：正常

K：未克隆出

二：

质粒构建：

1）ABCDRK+ PNZ 8148（问题：连好T-5载体的质粒酶切切不开！？）

2）DRK+PBBR3MCS-5（初步采用PCR）

3）PET28b（含蓝光色素蛋白），启动子替换（酶切）→+PHY300PLK

4）PNZ 8148+蓝光色素蛋白→证明启动子好用

5）plsr+蓝光色素蛋白+ PNZ 8148→证明启动子好用

大肠杆菌（MC1061）感受态制备：

主要试剂

（1）0.1mol/L CaCl2溶液

（2）LB液体培养基

（3）30%甘油：30mL甘油溶于100mL蒸馏水，高压灭菌。

主要设备

（1）超净工作台

（2）冷冻离心机

（3）恒温摇床

（4）－70℃冰箱

（5）10mL移液管

（6）吸耳球

（7）1mL、200μL移液枪（配套枪头）

（8）50mL 离心管

（9）1.5mL离心管

实验材料：大肠杆菌

实验步骤

（一）受体菌的培养

（1）从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落，接种于3～5mL LB液体培养基中，37℃下振荡培养过夜（12h左右）。

（2）将该菌种悬液以1:100的比例接种，取250μL菌液转接到25mL LB液体培养基中，37℃振荡培养2～3h至OD600＝0.5左右。

（二）感受态细胞的制备（注意：以下操作在超净工作台完成。）

（1）将菌液转入50mL离心管中，冰上放置10min。

（2）在4℃下，4000r/min离心10min。弃去上清，将管倒置1min以便培养液流尽。

（3）用冰上预冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液10mL轻轻悬浮细胞，冰上放置30min。

（4）0～4℃ 4000r/min离心10min，弃去上清，加入2mL预冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置（务必冰上放置）。（注意：以上操作完成了新鲜感受态细胞的制备）

（三）感受态细胞的分装与冻存

（1）在2mL制备好的感受态细胞中加入2mL30%甘油（即1:1体积，甘油终浓度15%）。

（2）将此感受态细胞分装成每份200μL （1.5mL dorf管），液氮速冻，快速转入-70℃冰箱保存。（如果没有液氮，可以将分装的感受态细胞直接转入-70℃冰箱保存。）

注意事项

⑴、细胞的生长状态和密度

最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。不要用已 经过多次转接，及贮存在4℃的培养菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的OD600控制。对TG1菌株，OD600为0．5时，细胞密度在5×107个/ml左右。（应注意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同）。密度过高或不足均会使转化率下降。 此外，受体细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。并且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。

⑵、试剂的质量

所用的CaCl2等试剂均需是最高纯度的，并用最纯净的水配制，最好分装保存于4℃。

⑶、防止杂菌和杂DNA的污染

整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入。

⑷、整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。

三：

AI-2的化学检测：

标品：抗坏血酸

标准曲线：抗坏血酸标准曲线

试剂：

1、10 mM 1，10-phenanthroline/3.32 mM Fe（III） ：1，10-phenanthroline（0.198 g）+去离子蒸馏水（50 mL），用1 M HCl调pH 2。

2、硫酸铁铵 （0.16 g）加到去离子蒸馏水（100 mL）中。

步骤：

标准：0.5 mM ascorbic acid

对于Fe（III）离子减少的检测 ，1 mL 样品（colony rinse in SNSS or cell free supernatant from a bacterial culture） +1 mL Fe（III）-1，10- phenanthroline 反应1 min ，用水稀释到5 mL，过0.2 μm滤膜，510nm测吸光度。

Negative control：培养基without ascorbic acid （20 μM）

positive control：培养基with ascorbic acid （20 μM）

干扰因素：

0.5Mammonium acetate

0.5M sodium hydroxide and

0.5 M N-（ß-ketocaproyl）-homoserine lactone （3-oxo-C6-AHL）

四：

保加利亚乳酸菌感受态的制备及电转化

实验前准备

1、 筛选转化子的抗生素浓度的确定

分别配制 含 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0 μg/mL 抗生素的 MRS 抗生素平板，涂布生长至对数期的保加利亚乳杆菌，37℃静止培养 36～48 h 观察结果， 根据抗生素平板上乳杆菌的生长情况确定抗生素的浓度。

2、保加利亚乳杆菌菌株在不同培养基中生长曲线的测定

将单菌落接入 10 mL MRS 培养液中，37 ℃静置培养过夜后， 以 2%接种量分别接入 100 mL含 2.5%甘氨酸的液体SMRS 培养基中，37 ℃静置培养，每隔 2 h 取样，于波长 600 nm处测 OD 值。得到对数中期的时间（文献中为8h）

乳杆菌感受态细胞的制备与电转化

1、将单菌落接入10 mL MRS 培养液中，37 ℃静置培养过夜

2、感受态细胞的培养：（以 2%接种量分别接入100 mL 2.5%甘氨酸的液体 SMRS 培养基中 37 ℃静置培养，冷却（将培养物置于冰上 20～30 min），离心洗涤与细胞重悬（6 000 r/min 离心 10 min，收集菌体，用 PB 缓冲液洗涤 3 次后，再用1 mL PB 缓冲液重悬菌体）。

3、感受态细胞与质粒 DNA 混合（吸取 50 μL 新制备的感受态细胞悬液到预冷的无菌EP 管中，加入 1 μL 质量浓度为 1 μg/μL 的质粒，冰浴 5 min， 将此混合液加入预冷的 2 mm 电转化杯中）高压脉冲电击转化（电场强度 12 kV/cm，电阻 200 Ω、电容 25 μF）。

4、转化子复苏（电击完毕后迅速向电转化杯中加入950 μL含有 20 mmol/L（MgCl2、CaCl2）的 SMRS 液体培养基，混匀后倒入无菌 EP 管中，37 ℃静置培养2 h）。

5、转化子培养与筛选 （取用再生液体培养基稀释后的电击转化细胞液 100 μL，涂布到含相应浓度的抗生素的 MRS 平板上，37 ℃倒置培养 36～48 h 后，计数转化子并计算转化效率）。

五：

表达产物分析：

RNA水平：多重PCR

蛋白质水平：SDS-PAGE

制 胶

1、试 剂

1） 丙烯酰胺（电泳级）

2） 双丙烯酰胺（N，N—甲叉双丙烯酰肢）

3） Tris 絨

4） SDS （十二烷基磺酸钠）

5） TEMED

6） 过硫酸铵

7） α-巯基乙醇

8） 甘油

9） 溴酚蓝

10）甘氨酸

11）盐酸

12） DTT

2、储存液

（1） 2M Tris-HCl（pH8.8），100ml

称取 24.2g Tris 碱；

加50ml蒸馏水；

缓慢的加浓盐酸至pH8.8 （约加4ml）；让溶液冷却至室温，pH将会升高；

加蒸馏水至100ml

（2）1M Tris-HCI（pH6.8），100ml

称取12.1g的Tris碱；

加50ml蒸馏水；

缓慢的加浓盐酸至pH6.8（约加8ml）；让溶液冷却至室温，pH将会升高L；

加蒸馏水至总量100ml.

（3）10%（w/v）SDS，100ml 室温保存

 称取10g的SDS；

加蒸馏水至总量为100ml。

（4）50%（v/v）甘油，100ml

到取 50ml 100%的甘油；

加人5ml蒸馏水。

（5）1% （w/v）溴酚蓝，10ml

称取100mg溴酚蓝；

加蒸馏水至10ml，搅拌直到完全溶解；

过滤除去聚合的染料。

3、 工作液

（1）    A液：丙烯酰胺储存液，100ml

30% （w/v）丙烯酰胺，0.8%（w/v）双丙烯酰胺。

29.2g丙烯酰胺

0.8g双丙烯酰胺

（2）B液：4X分离胶缓冲液，100ml

75ml 2 mol/L Tris-HCl（pH8.8）      1.5 mol/L

4ml 10% SDS   0.4%

21ml蒸馏水

可在4°C存放数月。

（3）C液：4X堆积胶缓冲液，100ml

50ml 1 mol/L Tris-HCI （pH6.8）    0.5mol/L

4ml 10%SDS                  0.4%

46ml蒸馏水 可在41：存放数月。

（4）    10%过硫酸铵，5m丨 0.5g过硫酸铵

5mJ蒸溜水

可在密封的管内，4C存放数月。

（5）    电泳缓冲液，1L

3g Tris 碱   25mM

14.4g 甘氨酸    192mM

IgSDS  0-1%

加蒸馏水至1L

pH应该在8.3左右。也可以制成10x的储存液，在室 温下长期保存。

（6）5X样品缓冲液，10ml

0.6ml 1mol/L 的Tris-HCl（pH6.8）          60mmol/L

5ml 50%的甘油                        25%

2ml 10%的SDS                       2%

0.5ml 2-巯基乙醇                      14.4mmol/L 

1ml 1％溴酚蓝                       0.1%

0.9ml的蒸馏水

可在4°C保存数周，或许-20C保存数月