igem-2015实验总纲
材料:
菌株:保加利亚乳杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、哈氏弧菌BB152、MC1061(待买)
质粒:PNZ8148、PHY300PLK、PBBR1MCS-5、PNZ9530(是否购买看实验结果)
一:
基因克隆
A:多一个碱基→初步采用SOE-PCR解决
B:正常
C:正常(中间含一段碱基序列,但未造成移码)
D:多一个碱基→初步采用SOE-PCR解决
R:正常
K:未克隆出
二:
质粒构建:
1)ABCDRK+ PNZ 8148(问题:连好T-5载体的质粒酶切切不开!?)
2)DRK+PBBR3MCS-5(初步采用PCR)
3)PET28b(含蓝光色素蛋白),启动子替换(酶切)→+PHY300PLK
4)PNZ 8148+蓝光色素蛋白→证明启动子好用
5)plsr+蓝光色素蛋白+ PNZ 8148→证明启动子好用
大肠杆菌(MC1061)感受态制备:
主要试剂
(1)0.1mol/L CaCl2溶液
(2)LB液体培养基
(3)30%甘油:30mL甘油溶于100mL蒸馏水,高压灭菌。
主要设备
(1)超净工作台
(2)冷冻离心机
(3)恒温摇床
(4)-70℃冰箱
(5)10mL移液管
(6)吸耳球
(7)1mL、200μL移液枪(配套枪头)
(8)50mL 离心管
(9)1.5mL离心管
实验材料:大肠杆菌
实验步骤
(一)受体菌的培养
(1)从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落,接种于3~5mL LB液体培养基中,37℃下振荡培养过夜(12h左右)。
(2)将该菌种悬液以1:100的比例接种,取250μL菌液转接到25mL LB液体培养基中,37℃振荡培养2~3h至OD600=0.5左右。
(二)感受态细胞的制备(注意:以下操作在超净工作台完成。)
(1)将菌液转入50mL离心管中,冰上放置10min。
(2)在4℃下,4000r/min离心10min。弃去上清,将管倒置1min以便培养液流尽。
(3)用冰上预冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液10mL轻轻悬浮细胞,冰上放置30min。
(4)0~4℃ 4000r/min离心10min,弃去上清,加入2mL预冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置(务必冰上放置)。(注意:以上操作完成了新鲜感受态细胞的制备)
(三)感受态细胞的分装与冻存
(1)在2mL制备好的感受态细胞中加入2mL30%甘油(即1:1体积,甘油终浓度15%)。
(2)将此感受态细胞分装成每份200μL (1.5mL dorf管),液氮速冻,快速转入-70℃冰箱保存。(如果没有液氮,可以将分装的感受态细胞直接转入-70℃冰箱保存。)
注意事项
⑴、细胞的生长状态和密度
最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。不要用已 经过多次转接,及贮存在4℃的培养菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌,可通过测定培养液的OD600控制。对TG1菌株,OD600为0.5时,细胞密度在5×107个/ml左右。(应注意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同)。密度过高或不足均会使转化率下降。 此外,受体细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的突变株,即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。并且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。
⑵、试剂的质量
所用的CaCl2等试剂均需是最高纯度的,并用最纯净的水配制,最好分装保存于4℃。
⑶、防止杂菌和杂DNA的污染
整个操作过程均应在无菌条件下进行,所用器皿,如离心管,移液枪头等最好是新的,并经高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染,否则均会影响转化效率或杂DNA的转入。
⑷、整个操作均需在冰上进行,不能离开冰浴,否则细胞转化率将会降低。
三:
AI-2的化学检测:
标品:抗坏血酸
标准曲线:抗坏血酸标准曲线
试剂:
1、10 mM 1,10-phenanthroline/3.32 mM Fe(III) :1,10-phenanthroline(0.198 g)+去离子蒸馏水(50 mL),用1 M HCl调pH 2。
2、硫酸铁铵 (0.16 g)加到去离子蒸馏水(100 mL)中。
步骤:
标准:0.5 mM ascorbic acid
对于Fe(III)离子减少的检测 ,1 mL 样品(colony rinse in SNSS or cell free supernatant from a bacterial culture) +1 mL Fe(III)-1,10- phenanthroline 反应1 min ,用水稀释到5 mL,过0.2 μm滤膜,510nm测吸光度。
Negative control:培养基without ascorbic acid (20 μM)
positive control:培养基with ascorbic acid (20 μM)
干扰因素:
0.5Mammonium acetate
0.5M sodium hydroxide and
0.5 M N-(ß-ketocaproyl)-homoserine lactone (3-oxo-C6-AHL)
四:
保加利亚乳酸菌感受态的制备及电转化
实验前准备
1、 筛选转化子的抗生素浓度的确定
分别配制 含 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0 μg/mL 抗生素的 MRS 抗生素平板,涂布生长至对数期的保加利亚乳杆菌,37℃静止培养 36~48 h 观察结果, 根据抗生素平板上乳杆菌的生长情况确定抗生素的浓度。
2、保加利亚乳杆菌菌株在不同培养基中生长曲线的测定
将单菌落接入 10 mL MRS 培养液中,37 ℃静置培养过夜后, 以 2%接种量分别接入 100 mL含 2.5%甘氨酸的液体SMRS 培养基中,37 ℃静置培养,每隔 2 h 取样,于波长 600 nm处测 OD 值。得到对数中期的时间(文献中为8h)
乳杆菌感受态细胞的制备与电转化
1、将单菌落接入10 mL MRS 培养液中,37 ℃静置培养过夜
2、感受态细胞的培养:(以 2%接种量分别接入100 mL 2.5%甘氨酸的液体 SMRS 培养基中 37 ℃静置培养,冷却(将培养物置于冰上 20~30 min),离心洗涤与细胞重悬(6 000 r/min 离心 10 min,收集菌体,用 PB 缓冲液洗涤 3 次后,再用1 mL PB 缓冲液重悬菌体)。
3、感受态细胞与质粒 DNA 混合(吸取 50 μL 新制备的感受态细胞悬液到预冷的无菌EP 管中,加入 1 μL 质量浓度为 1 μg/μL 的质粒,冰浴 5 min, 将此混合液加入预冷的 2 mm 电转化杯中)高压脉冲电击转化(电场强度 12 kV/cm,电阻 200 Ω、电容 25 μF)。
4、转化子复苏(电击完毕后迅速向电转化杯中加入950 μL含有 20 mmol/L(MgCl2、CaCl2)的 SMRS 液体培养基,混匀后倒入无菌 EP 管中,37 ℃静置培养2 h)。
5、转化子培养与筛选 (取用再生液体培养基稀释后的电击转化细胞液 100 μL,涂布到含相应浓度的抗生素的 MRS 平板上,37 ℃倒置培养 36~48 h 后,计数转化子并计算转化效率)。
五:
表达产物分析:
RNA水平:多重PCR
蛋白质水平:SDS-PAGE
制 胶
1、试 剂
1) 丙烯酰胺(电泳级)
2) 双丙烯酰胺(N,N—甲叉双丙烯酰肢)
3) Tris 絨
4) SDS (十二烷基磺酸钠)
5) TEMED
6) 过硫酸铵
7) α-巯基乙醇
8) 甘油
9) 溴酚蓝
10)甘氨酸
11)盐酸
12) DTT
2、储存液
(1) 2M Tris-HCl(pH8.8),100ml
称取 24.2g Tris 碱;
加50ml蒸馏水;
缓慢的加浓盐酸至pH8.8 (约加4ml);让溶液冷却至室温,pH将会升高;
加蒸馏水至100ml
(2)1M Tris-HCI(pH6.8),100ml
称取12.1g的Tris碱;
加50ml蒸馏水;
缓慢的加浓盐酸至pH6.8(约加8ml);让溶液冷却至室温,pH将会升高L;
加蒸馏水至总量100ml.
(3)10%(w/v)SDS,100ml 室温保存
称取10g的SDS;
加蒸馏水至总量为100ml。
(4)50%(v/v)甘油,100ml
到取 50ml 100%的甘油;
加人5ml蒸馏水。
(5)1% (w/v)溴酚蓝,10ml
称取100mg溴酚蓝;
加蒸馏水至10ml,搅拌直到完全溶解;
过滤除去聚合的染料。
3、 工作液
(1) A液:丙烯酰胺储存液,100ml
30% (w/v)丙烯酰胺,0.8%(w/v)双丙烯酰胺。
29.2g丙烯酰胺
0.8g双丙烯酰胺
(2)B液:4X分离胶缓冲液,100ml
75ml 2 mol/L Tris-HCl(pH8.8) 1.5 mol/L
4ml 10% SDS 0.4%
21ml蒸馏水
可在4°C存放数月。
(3)C液:4X堆积胶缓冲液,100ml
50ml 1 mol/L Tris-HCI (pH6.8) 0.5mol/L
4ml 10%SDS 0.4%
46ml蒸馏水 可在41:存放数月。
(4) 10%过硫酸铵,5m丨 0.5g过硫酸铵
5mJ蒸溜水
可在密封的管内,4C存放数月。
(5) 电泳缓冲液,1L
3g Tris 碱 25mM
14.4g 甘氨酸 192mM
IgSDS 0-1%
加蒸馏水至1L
pH应该在8.3左右。也可以制成10x的储存液,在室 温下长期保存。
(6)5X样品缓冲液,10ml
0.6ml 1mol/L 的Tris-HCl(pH6.8) 60mmol/L
5ml 50%的甘油 25%
2ml 10%的SDS 2%
0.5ml 2-巯基乙醇 14.4mmol/L
1ml 1%溴酚蓝 0.1%
0.9ml的蒸馏水
可在4°C保存数周,或许-20C保存数月