Difference between revisions of "Teams:Lethbridge/Notebook July"

(Created page with "<html> <head> <title>iGEM</title> <meta charset="UTF-8"> <!-- CSS --> <link rel="stylesheet" type="text/css" href="https://2015.igem.org/T...")
 
(Blanked the page)
 
Line 1: Line 1:
−
<html>
 
−
    <head>
 
−
        <title>iGEM</title>
 
  
−
        <meta charset="UTF-8">
 
−
 
−
        <!-- CSS -->
 
−
        <link rel="stylesheet" type="text/css" href="https://2015.igem.org/Team:Lethbridge/main_css?action=raw&ctype=text/css">
 
−
        <link rel="stylesheet" type="text/css" href="https://2015.igem.org/Team:Lethbridge/notebook_css?action=raw&ctype=text/css">
 
−
 
−
        <!-- JAVASCRIPT -->
 
−
        <script type="text/javascript" src="https://2015.igem.org/Team:Lethbridge/jQuery2-1-3_js?action=raw&ctype=text/javascript"></script>
 
−
        <script type="text/javascript" src="https://2015.igem.org/Team:Lethbridge/randomize_js?action=raw&ctype=text/javascript"></script>
 
−
        <script type="text/javascript" src="https://2015.igem.org/Team:Lethbridge/notebook_js?action=raw&ctype=text/javascript"></script>
 
−
    </head>
 
−
 
−
    <body>
 
−
 
−
        <div id="wrapper">
 
−
 
−
            <div id="menu_bar">
 
−
                <ul>
 
−
                    <li><a href="https://2015.igem.org/">iGEM</a></li>
 
−
                    <li><a href="https://2015.igem.org/Teams:Lethbridge">RNAiCare</a></li>
 
−
                    <li>
 
−
                        <a href="https://2015.igem.org/Teams:Lethbridge/Project">Project</a>
 
−
                        <ul>
 
−
                            <li><a href="https://2015.igem.org/Teams:Lethbridge/Description">Description</a></li>
 
−
                            <li><a href="https://2015.igem.org/Teams:Lethbridge/Design">Design</a></li>
 
−
                            <li><a href="https://2015.igem.org/Teams:Lethbridge/Results">Results</a></li>
 
−
                            <li><a href="https://2015.igem.org/Teams:Lethbridge/Project_Production">Production</a></li>
 
−
                            <li><a href="https://2015.igem.org/Teams:Lethbridge/Project_Judging"></a></li>
 
−
                        </ul>
 
−
                    </li>
 
−
                    <li>
 
−
                        <a href="https://2015.igem.org/Teams:Lethbridge/Parts">Parts</a>
 
−
                        <ul>
 
−
                            <li><a href="Basic_Part.html">Basic Parts</a></li>
 
−
                            <li><a href="Composite_Part.html">Composite Parts</a></li>
 
−
                            <li><a href="https://2015.igem.org/Teams:Lethbridge/Measurement">Measurement</a></li>
 
−
                        </ul>
 
−
                    </li>
 
−
                    <li>
 
−
                        <a href="https://2015.igem.org/Teams:Lethbridge/Practices">Practices</a>
 
−
                        <ul>
 
−
                            <li><a href="https://2015.igem.org/Teams:Lethbridge/Practices_Risks">Risks</a></li>
 
−
                            <li><a href="https://2015.igem.org/Teams:Lethbridge/Practices_Stakeholders">Stakeholders</a></li>
 
−
                            <li><a href="https://2015.igem.org/Teams:Lethbridge/Practices_Current">Current Problems</a></li>
 
−
                        </ul>
 
−
                    </li>
 
−
                    <li>
 
−
                        <a href="https://2015.igem.org/Teams:Lethbridge/Notebook">Notebook</a>
 
−
                        <ul>
 
−
                            <li><a href="https://2015.igem.org/Teams:Lethbridge/Notebook_July">July</a></li>
 
−
                            <li><a href="https://2015.igem.org/Teams:Lethbridge/Notebook_August">August</a></li>
 
−
                            <li><a href="https://2015.igem.org/Teams:Lethbridge/Notebook_September">September</a></li>
 
−
                        </ul>
 
−
                    </li>
 
−
 
−
                    <li>
 
−
                        <a href="https://2015.igem.org/Teams:Lethbridge/Software">Software</a>
 
−
                    </li>
 
−
                    <li>
 
−
                        <a href="https://2015.igem.org/Teams:Lethbridge/Team">Team</a>
 
−
                        <ul>
 
−
                            <li><a href="https://2015.igem.org/Teams:Lethbridge/Team_Members">Members</a></li>
 
−
                            <li><a href="https://2015.igem.org/Teams:Lethbridge/Collaborations">Collaborations</a></li>
 
−
                            <li><a href="https://2015.igem.org/Teams:Lethbridge/Attributions">Attributions</a></li>
 
−
                            <li><a href="https://2015.igem.org/Teams:Lethbridge/Sponsors">Sponsors</a></li>
 
−
                        </ul>
 
−
                    </li>
 
−
                </ul>
 
−
            </div>
 
−
 
−
            <div id="content_wrapper">
 
−
 
−
                <div class="mini_banner">
 
−
                </div>
 
−
 
−
                <div class="content_box">
 
−
 
−
                    <!-- Notebook Entry -->
 
−
                    <div class="notebook_entry">
 
−
                        <div class="entry_day">
 
−
                            <div>9</div>
 
−
                        </div>
 
−
                        <div class="entry_content">
 
−
                            <div class="entry_title">
 
−
                                <h1>PCR &amp; Transformation</h1>
 
−
                            </div>
 
−
                            <div class="entry_data">
 
−
                                <h2>Thermo Scientific CloneJET PCR Cloning Kit (#K1232)</h2>
 
−
                                <p>G-blocks to be ligated into pJET 1.2/blunt cloning vector</p>
 
−
                                <ol style="list-style-type:lower-roman;">
 
−
                                    <li>RNAi 2015 iGEM TT ribozyme test construct (positive control)</li>
 
−
                                    <li>RNAi 2015 iGEM TT ribozyme test construct (GFP sense)</li>
 
−
                                    <li>RNAi 2015 iGEM TT ribozyme test construct (GFP anti-sense)</li>
 
−
                                </ol>
 
−
                                <ol>
 
−
                                    <li>
 
−
                                        <table>
 
−
                                            <tr> <th>Component</th>          <th>Volume (&mu;L)</th> </tr>
 
−
                                            <tr> <td>2x Reaction Buffer</td>  <td>10</td>            </tr>
 
−
                                            <tr> <td>DNA fragment</td>        <td>1</td>              </tr>
 
−
                                            <tr> <td>dH2O</td>                <td>6</td>              </tr>
 
−
                                            <tr> <td>DNA blunting enzyme</td> <td>1</td>              </tr>
 
−
                                        </table>
 
−
                                        Total volume: 18&mu;L
 
−
                                    </li>
 
−
                                    <li>Vortex briefly and centrifuge for 3-5 seconds</li>
 
−
                                    <li>Incubate the mixture at 70&deg;C for 5 minutes and chill on ice</li>
 
−
                                    <li>
 
−
                                        Set up the ligation reaction on ice. Add the following to the blunting reaction mixture
 
−
                                        <table>
 
−
                                            <tr> <th>Component</th>                                  <th>Volume (&mu;L)</th> </tr>
 
−
                                            <tr> <td>pJET 1.2/blunt cloning vector (50ng/&mu;L)</td>  <td>1</td>              </tr>
 
−
                                            <tr> <td>T4 DNA ligase</td>                              <td>1</td>              </tr>
 
−
                                        </table>
 
−
                                        Total volume: 2&mu;L
 
−
                                    </li>
 
−
                                    <li>Vortex briefly and centrifuge for 3-5 seconds</li>
 
−
                                    <li>Incubate the ligation mixture at room temperature (22&deg;C) for 5 minutes. For PCR products &gt;3kb, ligation can be prolonged to 30 minutes</li>
 
−
                                    <li>Use the ligation mixture directly for transformation. Keep the ligation mixture at -20&deg;C if transformation is postponed. Thaw on ice and mix carefully before transformation</li>
 
−
                                </ol>
 
−
                                <p>Note: Use only 1&mu;L from this reaction mixture into 20&mu;L of high efficiency cells</p>
 
−
                                <h2>Transformation using High Efficiency Cells</h2>
 
−
                                <ol>
 
−
                                    <li>Thaw component DH5&alpha; cells</li>
 
−
                                    <li>Add 1&mu;L of DNA to 25&mu;L of competent DH5&alpha; cells</li>
 
−
                                    <li>Incubate on ice for 30 minutes</li>
 
−
                                    <li>Incubate at 42&deg;C for 45 seconds</li>
 
−
                                    <li>Incubate on ice for 5 minutes</li>
 
−
                                    <li>Add 400&mu;L of LB media</li>
 
−
                                    <li>Incubate while shaking (RNA common room 37&deg;C shakers) for 1 hour</li>
 
−
                                    <li>Plate 300&mu;L of cells on one plate</li>
 
−
                                    <li>Plate 100&mu;L of cells on another plate</li>
 
−
                                </ol>
 
−
                                <p>Note:</p>
 
−
                                <uL>
 
−
                                    <li>J23101 - pSBIC3</li>
 
−
                                    <li>I13504 - pSBIA2</li>
 
−
                                    <li>J23106 - pSBIC3</li>
 
−
                                    <li>J23117 - pSBIC3</li>
 
−
                                </ul>
 
−
                            </div>
 
−
                            <div class="entry_expand_button">
 
−
                                More &darr;
 
−
                            </div>
 
−
                        </div>
 
−
                    </div>
 
−
                    <!-- End Notebook Entry -->
 
−
 
−
                    <!-- Notebook Entry -->
 
−
                    <div class="notebook_entry">
 
−
                        <div class="entry_day">
 
−
                            <div>13</div>
 
−
                        </div>
 
−
                        <div class="entry_content">
 
−
                            <div class="entry_title">
 
−
                                <h1>Transformation</h1>
 
−
                            </div>
 
−
                            <div class="entry_data">
 
−
                                <h2>Transformation of BBA_I13504 using High Efficiency Cells</h2>
 
−
                                <ol>
 
−
                                    <li>Thaw component DH5&alpha; cells</li>
 
−
                                    <li>Add 1&mu;L of DNA to 25&mu;L of competent DH5&alpha; cells</li>
 
−
                                    <li>Incubate on ice for 30 minutes</li>
 
−
                                    <li>Incubate at 42&deg;C for 45 seconds</li>
 
−
                                    <li>Incubate on ice for 5 minutes</li>
 
−
                                    <li>Add 400&mu;L of LB media</li>
 
−
                                    <li>Incubate while shaking (RNA common room 37&deg;C shakers) for 1 hour</li>
 
−
                                    <li>Plate 400&mu;L of cells on one plate</li>
 
−
                                </ol>
 
−
                                <p>3 devices to be built:</p>
 
−
                                <uL>
 
−
                                    <li>J23101 + I13504</li>
 
−
                                    <li>J23106 + I13504</li>
 
−
                                    <li>J23117 + I13504</li>
 
−
                                </ul>
 
−
                            </div>
 
−
                            <div class="entry_expand_button">
 
−
                                More &darr;
 
−
                            </div>
 
−
                        </div>
 
−
                    </div>
 
−
                    <!-- End Notebook Entry -->
 
−
 
−
                    <!-- Notebook Entry -->
 
−
                    <div class="notebook_entry">
 
−
                        <div class="entry_day">
 
−
                            <div>14</div>
 
−
                        </div>
 
−
                        <div class="entry_content">
 
−
                            <div class="entry_title">
 
−
                                <h1>Miniprep &amp; Glycerol Stock Protocol</h1>
 
−
                            </div>
 
−
                            <div class="entry_data">
 
−
                                <h2>Miniprepping Plasmid DNA (Bio Basic Inc)</h2>
 
−
                                <ol>
 
−
                                    <li>Add 2 mL overnight culture into a micro-centrifuge tube, centrifuge for 2 minutes at 12,000 rpm and pour off supernatant.</li>
 
−
                                    <li>Add 100&mu;L of Solution I to the pellet, mix well and incubate at room temperature for 1 minute</li>
 
−
                                    <li>Add 200&mu;L of Solution II to the pellet, mix by inverting and incubate at room temperature for 1 minute (do not vortex)</li>
 
−
                                    <li>Add 350&mu;L of Solution III, mix by inverting and incubate at room temperature for 1 minute</li>
 
−
                                    <li>Centrifuge at 12,000 rpm for 5 minutes</li>
 
−
                                    <li>Transfer the supernatant to the EZ-10 column and centrifuge at 10,000 rpm for 2 minutes</li>
 
−
                                    <li>Discard the flow through, add 700&mu;L of Wash Solution and centrifuge at 10,000 rpm for 2 minutes</li>
 
−
                                    <li>Repeat step 7</li>
 
−
                                    <li>Discard the flow through in the collection tube and spin at 10,000 rpm for 2 minutes (to remove residual EtOH)</li>
 
−
                                    <li>Transfer the column to a clean microcentrifuge tube. Add 50&mu;L of elution buffer into the center of the column and incubate at room temperature for 2 minutes.</li>
 
−
                                    <li>Spin down sample for 2 minutes at 10,000 rpm and save flow through</li>
 
−
                                    <li>Store purified DNA at -20&deg;C</li>
 
−
                                </ol>
 
−
                                <h2>Glycerol Stock Protocol</h2>
 
−
                                <ol>
 
−
                                    <li>Add 500&mu;L of overnight culture to cryo-tube containing 500&mu;L glycerol</li>
 
−
                                    <li>Pipette up and down to ensure homogeneity</li>
 
−
                                    <li>Place in liquid nitrogen to freeze</li>
 
−
                                    <li>Transfer to freezer box in -80&deg;C freezer</li>
 
−
                                </ol>
 
−
                            </div>
 
−
                            <div class="entry_expand_button">
 
−
                                More &darr;
 
−
                            </div>
 
−
                        </div>
 
−
                    </div>
 
−
                    <!-- End Notebook Entry -->
 
−
 
−
                    <!-- Notebook Entry -->
 
−
                    <div class="notebook_entry">
 
−
                        <div class="entry_day">
 
−
                            <div>15</div>
 
−
                        </div>
 
−
                        <div class="entry_content">
 
−
                            <div class="entry_title">
 
−
                                <h1>Single Digest &amp; PCR</h1>
 
−
                            </div>
 
−
                            <div class="entry_data">
 
−
                                <h2>Single Digest of Miniprep DNA</h2>
 
−
                                <ol>
 
−
                                    <li> Set up digest reactions
 
−
                                        <table>
 
−
                                            <tr> <th>Component</th>                  <th>Volume (&mu;L)</th> </tr>
 
−
                                            <tr> <td>dH2O</td>                        <td>4.5</td>            </tr>
 
−
                                            <tr> <td>10x Cut smart buffer (NEB)</td>  <td>1</td>              </tr>
 
−
                                            <tr> <td>Miniprep DNA</td>                <td>4</td>              </tr>
 
−
                                            <tr> <td>EcoRI (NEB)</td>                <td>0.5</td>            </tr>
 
−
                                        </table>
 
−
                                        Total volume: 10&mu;L
 
−
                                    </li>
 
−
                                    <li>Incubate at 37&deg;C for 1 hour</li>
 
−
                                    <li>Run a 1% agarose gel on the single digest reactions
 
−
                                        <table>
 
−
                                            <tr> <th>Lane</th> <th>Component</th>                          <th>Volume (&mu;L)</th>                      </tr>
 
−
                                            <tr> <td>1</td>    <td>1 kb DNA ladder</td>                    <td>2&mu;L</td>                              </tr>
 
−
                                            <tr> <td>2</td>    <td>J23106 DNA(1) + EcoRI</td>              <td>10&mu;L of reaction + 2&mu;L of dye</td> </tr>
 
−
                                            <tr> <td>3</td>    <td>J23117 DNA(1) + EcoRI</td>              <td>10&mu;L of reaction + 2&mu;L of dye</td> </tr>
 
−
                                            <tr> <td>4</td>    <td>J23117 DNA(2) + EcoRI</td>              <td>10&mu;L of reaction + 2&mu;L of dye</td> </tr>
 
−
                                            <tr> <td>5</td>    <td>I13504 DNA(1) + EcoRI</td>              <td>10&mu;L of reaction + 2&mu;L of dye</td> </tr>
 
−
                                            <tr> <td>6</td>    <td>I13504 DNA(2) + EcoRI</td>              <td>10&mu;L of reaction + 2&mu;L of dye</td> </tr>
 
−
                                            <tr> <td>7</td>    <td>J23103 DNA(1) + EcoRI</td>              <td>10&mu;L of reaction + 2&mu;L of dye</td> </tr>
 
−
                                            <tr> <td>8</td>    <td>TTr positive control DNA(1) + EcoRI</td> <td>10&mu;L of reaction + 2&mu;L of dye</td> </tr>
 
−
                                            <tr> <td>9</td>    <td>TTr positive control DNA(2) + EcoRI</td> <td>10&mu;L of reaction + 2&mu;L of dye</td> </tr>
 
−
                                            <tr> <td>10</td>  <td>TTr anti-sense DNA(1) + EcoRI</td>      <td>10&mu;L of reaction + 2&mu;L of dye</td> </tr>
 
−
                                            <tr> <td>11</td>  <td>TTr anti-sense DNA(2) + EcoRI</td>      <td>10&mu;L of reaction + 2&mu;L of dye</td> </tr>
 
−
                                            <tr> <td>12</td>  <td>TTr sense DNA(1) + EcoRI</td>            <td>10&mu;L of reaction + 2&mu;L of dye</td> </tr>
 
−
                                            <tr> <td>13</td>  <td>TTr sense DNA(2) + EcoRI</td>            <td>10&mu;L of reaction + 2&mu;L of dye</td> </tr>
 
−
                                            <tr> <td>14</td>  <td>1 kb DNA ladder</td>                    <td>2&mu;L</td>                              </tr>
 
−
                                        </table>
 
−
                                        Gel ran for 30 minutes at 135V
 
−
                                    </li>
 
−
                                </ol>
 
−
                                <h2>PCR of 3 TTr Pieces out of pJET</h2>
 
−
                                <ol>
 
−
                                    <li> Set up digest reactions
 
−
                                        <table>
 
−
                                            <tr> <th>Component</th>                        <th>Volume (&mu;L)</th> </tr>
 
−
                                            <tr> <td>pJET forward primer (10&mu;M)</td>    <td>0.5</td>            </tr>
 
−
                                            <tr> <td>pJET reverse primer (10&mu;M)</td>    <td>0.5</td>            </tr>
 
−
                                            <tr> <td>Phusion DNA polymerase (10&mu;M)</td> <td>0.5</td>            </tr>
 
−
                                            <tr> <td>DNA samples</td>                      <td>1</td>              </tr>
 
−
                                            <tr> <td>dNTPs</td>                            <td>0.4</td>            </tr>
 
−
                                            <tr> <td>Phusion HF buffer 5x</td>            <td>4</td>              </tr>
 
−
                                            <tr> <td>MilliQ H2O</td>                      <td>13.4</td>          </tr>
 
−
                                        </table>
 
−
                                        Total volume: 20&mu;L
 
−
                                    </li>
 
−
                                    <li>Incubate at 37&deg;C for 1 hour</li>
 
−
                                    <li>Run the reactions under the following conditions
 
−
                                        <ol>
 
−
                                            <li>Initial denaturation: 95&deg;C for 5 minutes</li>
 
−
                                            <li>Repeat 35 times:
 
−
                                                <ol>
 
−
                                                    <li>95&deg;C for 20 seconds</li>
 
−
                                                    <li>72&deg;C for 20 seconds</li>
 
−
                                                    <li>72&deg;C for 45 seconds</li>
 
−
                                                </ol>
 
−
                                            </li>
 
−
                                            <li>Final elongation: 72&deg;C for 5 minutes</li>
 
−
                                            <li>Hold at 4°C </li>
 
−
                                        </ol>
 
−
                                    </li>
 
−
                                    <li>Run an agarose gel using the PCR products</li>
 
−
                                </ol>
 
−
                            </div>
 
−
                            <div class="entry_expand_button">
 
−
                                More &darr;
 
−
                            </div>
 
−
                        </div>
 
−
                    </div>
 
−
                    <!-- End Notebook Entry -->
 
−
 
−
                    <!-- Notebook Entry -->
 
−
                    <div class="notebook_entry">
 
−
                        <div class="entry_day">
 
−
                            <div>16</div>
 
−
                        </div>
 
−
                        <div class="entry_content">
 
−
                            <div class="entry_title">
 
−
                                <h1>Restriction Digest &amp; Ligation</h1>
 
−
                            </div>
 
−
                            <div class="entry_data">
 
−
                                <h2>Restriction Digest of the Backbone DNA</h2>
 
−
                                <ol>
 
−
                                    <li>Set up double digests for the miniprep DNA
 
−
                                        <ol>
 
−
                                            <li>Reaction for the J23106, J23101 and J23117 samples in the pSBIC 3 vector
 
−
                                                <table>
 
−
                                                    <tr> <th>Component</th>                        <th>Volume (&mu;L)</th> </tr>
 
−
                                                    <tr> <td>10x CutSmart buffer</td>              <td>5</td>              </tr>
 
−
                                                    <tr> <td>Miniprep pDNA (47 - 561 ng/&mu;L)</td> <td>15</td>            </tr>
 
−
                                                    <tr> <td>MilliQ H2O</td>                        <td>28</td>            </tr>
 
−
                                                    <tr> <td>SpeI (10U/&mu;L)</td>                  <td>1</td>              </tr>
 
−
                                                    <tr> <td>PstI (20U/&mu;L)</td>                  <td>1</td>              </tr>
 
−
                                                </table>
 
−
                                                Total volume: 50&mu;L
 
−
                                            </li>
 
−
                                            <li>Reaction for the I13504 in the pSBIA2 vector
 
−
                                                <table>
 
−
                                                    <tr> <th>Component</th>                        <th>Volume (&mu;L)</th> </tr>
 
−
                                                    <tr> <td>10x CutSmart buffer</td>              <td>5</td>              </tr>
 
−
                                                    <tr> <td>Miniprep pDNA (47 - 561 ng/&mu;L)</td> <td>5</td>              </tr>
 
−
                                                    <tr> <td>MilliQ H2O</td>                        <td>38</td>            </tr>
 
−
                                                    <tr> <td>XbaI (20U/&mu;L)</td>                  <td>1</td>              </tr>
 
−
                                                    <tr> <td>PstI (20U/&mu;L)</td>                  <td>1</td>              </tr>
 
−
                                                </table>
 
−
                                                Total volume: 50&mu;L
 
−
                                            </li>
 
−
                                        </ol>
 
−
                                    </li>
 
−
                                    <li>Incubate at 37&deg;C for 1 hour</li>
 
−
                                    <li>1.00&mu;L SAP to J23106, J23101 and J23117</li>
 
−
                                    <li>Column purify digests as well as gel extracted small GFP part</li>
 
−
                                </ol>
 
−
                                <h2>Ligation of I13504 Fragment into Different Backbones</h2>
 
−
                                <p>Set up ligation reactions </p>
 
−
                                <ol>
 
−
                                    <li>Reaction 1 (prepare 2, one to be incubated at 16&deg;C and another at room temperature)
 
−
                                        <table>
 
−
                                            <tr><th>Component</th>                      <th>Volume (&mu;L)</th> </tr>
 
−
                                            <tr><td>Fresh T4 DNA ligase buffer 10x</td>  <td>1</td>              </tr>
 
−
                                            <tr><td>T4 DNA ligase</td>                  <td>0.5</td>            </tr>
 
−
                                            <tr><td>I13504 DNA part (gel extracted)</td> <td>2</td>              </tr>
 
−
                                            <tr><td>J23101 backbone</td>                <td>1</td>              </tr>
 
−
                                            <tr><td>dH2O</td>                            <td>5.5</td>            </tr>
 
−
                                        </table>
 
−
                                        Total volume: 10&mu;L
 
−
                                    </li>
 
−
                                    <li>Reaction 2
 
−
                                        <table>
 
−
                                            <tr><th>Component</th>                      <th>Volume (&mu;L)</th> </tr>
 
−
                                            <tr><td>Fresh T4 DNA ligase buffer 10x</td>  <td>1</td>              </tr>
 
−
                                            <tr><td>T4 DNA ligase</td>                  <td>0.5</td>            </tr>
 
−
                                            <tr><td>I13504 DNA part (gel extracted)</td> <td>1.1</td>            </tr>
 
−
                                            <tr><td>J23117 backbone</td>                <td>0.2</td>            </tr>
 
−
                                            <tr><td>dH2O</td>                            <td>7.5</td>            </tr>
 
−
                                        </table>
 
−
                                        Total volume: 10&mu;L
 
−
                                    </li>
 
−
                                    <li>Reaction 3
 
−
                                        <table>
 
−
                                            <tr><th>Component</th>                      <th>Volume (&mu;L)</th> </tr>
 
−
                                            <tr><td>Fresh T4 DNA ligase buffer 10x</td>  <td>1</td>              </tr>
 
−
                                            <tr><td>T4 DNA ligase</td>                  <td>0.5</td>            </tr>
 
−
                                            <tr><td>I13504 DNA part (gel extracted)</td> <td>1</td>              </tr>
 
−
                                            <tr><td>J23106 backbone</td>                <td>1</td>              </tr>
 
−
                                            <tr><td>dH2O</td>                            <td>5.5</td>            </tr>
 
−
                                        </table>
 
−
                                        Total volume: 10&mu;L
 
−
                                    </li>
 
−
                                    <li>Reaction 4
 
−
                                        <table>
 
−
                                            <tr><th>Component</th>                      <th>Volume (&mu;L)</th> </tr>
 
−
                                            <tr><td>Fresh T4 DNA ligase buffer 10x</td>  <td>1</td>              </tr>
 
−
                                            <tr><td>T4 DNA ligase</td>                  <td>0.5</td>            </tr>
 
−
                                            <tr><td>I13504 DNA part (gel extracted)</td> <td>3</td>              </tr>
 
−
                                            <tr><td>J23101 backbone</td>                <td>0.5</td>            </tr>
 
−
                                            <tr><td>dH2O</td>                            <td>5</td>              </tr>
 
−
                                        </table>
 
−
                                        Total volume: 10&mu;L
 
−
                                    </li>
 
−
                                    <li>Reaction 5
 
−
                                        <table>
 
−
                                            <tr><th>Component</th>                      <th>Volume (&mu;L)</th> </tr>
 
−
                                            <tr><td>Fresh T4 DNA ligase buffer 10x</td>  <td>1</td>              </tr>
 
−
                                            <tr><td>T4 DNA ligase</td>                  <td>0.5</td>            </tr>
 
−
                                            <tr><td>I13504 DNA part (gel extracted)</td> <td>3</td>              </tr>
 
−
                                            <tr><td>J23117 backbone</td>                <td>0.2</td>            </tr>
 
−
                                            <tr><td>dH2O</td>                            <td>5.3</td>            </tr>
 
−
                                        </table>
 
−
                                        Total volume: 10&mu;L
 
−
                                    </li>
 
−
                                    <li>Reaction 6
 
−
                                        <table>
 
−
                                            <tr><th>Component</th>                      <th>Volume (&mu;L)</th> </tr>
 
−
                                            <tr><td>Fresh T4 DNA ligase buffer 10x</td>  <td>1</td>              </tr>
 
−
                                            <tr><td>T4 DNA ligase</td>                  <td>0.5</td>            </tr>
 
−
                                            <tr><td>I13504 DNA part (gel extracted)</td> <td>3</td>              </tr>
 
−
                                            <tr><td>J23106 backbone</td>                <td>0.5</td>            </tr>
 
−
                                            <tr><td>dH2O</td>                            <td>5</td>              </tr>
 
−
                                        </table>
 
−
                                        Total volume: 10&mu;L
 
−
                                    </li>
 
−
                                </ol>
 
−
                            </div>
 
−
                            <div class="entry_expand_button">
 
−
                                More &darr;
 
−
                            </div>
 
−
                        </div>
 
−
                    </div>
 
−
                    <!-- End Notebook Entry -->
 
−
 
−
                    <!-- Notebook Entry -->
 
−
                    <div class="notebook_entry">
 
−
                        <div class="entry_day">
 
−
                            <div>17</div>
 
−
                        </div>
 
−
                        <div class="entry_content">
 
−
                            <div class="entry_title">
 
−
                                <h1>PCR</h1>
 
−
                            </div>
 
−
                            <div class="entry_data">
 
−
                                <h2>PCR of the TT Ribozyme Test Constructs</h2>
 
−
                                <ol>
 
−
                                    <li>Set up PCR reactions
 
−
                                        <ol>
 
−
                                            <li>Reaction using the TT ribozyme positive control DNA as template
 
−
                                                <table>
 
−
                                                    <tr> <th>Component</th>                      <th>Volume (&mu;L)</th> </tr>
 
−
                                                    <tr> <td>pJET forward primer (10&mu;M)</td>  <td>2</td>              </tr>
 
−
                                                    <tr> <td>pJET reverse primer (10&mu;M)</td>  <td>2</td>              </tr>
 
−
                                                    <tr> <td>Pfu DNA polymerase (2.5U/&mu;L)</td> <td>1</td>              </tr>
 
−
                                                    <tr> <td>DNA template</td>                    <td>0.75</td>          </tr>
 
−
                                                    <tr> <td>DNTPs (10mM)</td>                    <td>4</td>              </tr>
 
−
                                                    <tr> <td>10x PCR reaction bufferx</td>        <td>10</td>            </tr>
 
−
                                                    <tr> <td>MilliQ H2O</td>                      <td>80.25</td>          </tr>
 
−
                                                </table>
 
−
                                                Total volume: 100&mu;L
 
−
                                            </li>
 
−
                                            <li>Reactions using the TT ribozyme sense DNA and the TT ribozyme anti-sense DNA
 
−
                                                <table>
 
−
                                                    <tr> <th>Component</th>                      <th>Volume (&mu;L)</th> </tr>
 
−
                                                    <tr> <td>pJET forward primer (10&mu;M)</td>  <td>2</td>              </tr>
 
−
                                                    <tr> <td>pJET reverse primer (10&mu;M)</td>  <td>2</td>              </tr>
 
−
                                                    <tr> <td>Pfu DNA polymerase (2.5U/&mu;L)</td> <td>1</td>              </tr>
 
−
                                                    <tr> <td>DNA template</td>                    <td>0.5</td>            </tr>
 
−
                                                    <tr> <td>DNTPs (10mM)</td>                    <td>4</td>              </tr>
 
−
                                                    <tr> <td>10x PCR reaction buffer</td>        <td>10</td>            </tr>
 
−
                                                    <tr> <td>MilliQ H2O</td>                      <td>80.50</td>          </tr>
 
−
                                                </table>
 
−
                                                Total volume: 100&mu;L
 
−
                                            </li>
 
−
                                        </ol>
 
−
                                    </li>
 
−
                                    <li>Run the reactions using the following cycle
 
−
                                        <ol>
 
−
                                            <li>Initial denaturation: 95&deg;C for 5 minutes</li>
 
−
                                            <li>Repeat 35 times:
 
−
                                                <ol>
 
−
                                                    <li>95&deg;C for 20 seconds</li>
 
−
                                                    <li>72&deg;C for 20 seconds</li>
 
−
                                                    <li>72&deg;C for 45 seconds</li>
 
−
                                                </ol>
 
−
                                            </li>
 
−
                                            <li>Final elongation: 72&deg;C for 5 minutes</li>
 
−
                                            <li>Hold at 4°C </li>
 
−
                                        </ol>
 
−
                                    </li>
 
−
                                    <li>Run an agarose gel using the PCR products</li>
 
−
                                </ol>
 
−
                            </div>
 
−
                            <div class="entry_expand_button">
 
−
                                More &darr;
 
−
                            </div>
 
−
                        </div>
 
−
                    </div>
 
−
                    <!-- End Notebook Entry -->
 
−
 
−
                    <!-- Notebook Entry -->
 
−
                    <div class="notebook_entry">
 
−
                        <div class="entry_day">
 
−
                            <div>20</div>
 
−
                        </div>
 
−
                        <div class="entry_content">
 
−
                            <div class="entry_title">
 
−
                                <h1>Miniprep, Agarose Gel &amp; In Vitro Transcription</h1>
 
−
                            </div>
 
−
                            <div class="entry_data">
 
−
                                <h2>Miniprep Overnight Cultures</h2>
 
−
                                <ul>
 
−
                                    <li>RNA affinity purification colonies 1-5 were picked, this part is in pJET1.2</li>
 
−
                                    <li>Transformation #2 colonies 1-3</li>
 
−
                                    <li>Transformation #3 colonies 1-3</li>
 
−
                                </ul>
 
−
                                <h2>Miniprepping Plasmid DNA (Bio Basic Inc)</h2>
 
−
                                <ol>
 
−
                                    <li>Add 2mL overnight culture into a micro-centrifuge tube, centrifuge for 2 minutes at 12,000 rpm and pour off supernatant.</li>
 
−
                                    <li>Add 100&mu;L of Solution I to the pellet, mix well and incubate at room temperature for 1 minute</li>
 
−
                                    <li>Add 200&mu;L of Solution II to the pellet, mix by inverting and incubate at room temperature for 1 minute (do not vortex)</li>
 
−
                                    <li>Add 350&mu;L of Solution III, mix by inverting and incubate at room temperature for 1 minute</li>
 
−
                                    <li>Centrifuge at 12,000 rpm for 5 minutes</li>
 
−
                                    <li>Transfer the supernatant to the EZ-10 column and centrifuge at 10,000 rpm for 2 minutes</li>
 
−
                                    <li>Discard the flow through, add 700&mu;L of Wash Solution and centrifuge at 10,000 rpm for 2 minutes</li>
 
−
                                    <li>Repeat step 7</li>
 
−
                                    <li>Discard the flow through in the collection tube and spin at 10,000 rpm for 2 minutes (to remove residual EtOH)</li>
 
−
                                    <li>Transfer the column to a clean microcentrifuge tube. Add 50 μL of elution buffer into the center of the column and incubate at room temperature for 2 minutes.</li>
 
−
                                    <li>Spin down sample for 2 minutes at 10,000 rpm and save flow through</li>
 
−
                                    <li>Store purified DNA at -20&deg;C</li>
 
−
                                </ol>
 
−
                                <h2>Prepping DNA for Analysis on an Agarose Gel (11 Samples)</h2>
 
−
                                <ol>
 
−
                                    <li>Take 5&mu;L of your miniprep and put it into a small PCR tube</li>
 
−
                                    <li>Add 3&mu;L of dH2O</li>
 
−
                                    <li>Add 1&mu;L of 10x cutsmart buffer (NEB)</li>
 
−
                                    <li>Add 1&mu;L of EcoRI</li>
 
−
                                    <li>Digest for 1 hour at 37&deg;C</li>
 
−
                                </ol>
 
−
                                <h2>Run a 2% Agarose Gel at 135V for 25 Minutes</h2>
 
−
                                <table>
 
−
                                    <tr> <th>Lane</th> <th>Contents</th>                      </tr>
 
−
                                    <tr> <td>1</td>    <td>1kb ladder</td>                    </tr>
 
−
                                    <tr> <td>2</td>    <td>Antisense PCR reaction</td>        </tr>
 
−
                                    <tr> <td>3</td>    <td>Sense PCR reaction</td>            </tr>
 
−
                                    <tr> <td>4</td>    <td>Positive control PCR reaction</td> </tr>
 
−
                                    <tr> <td>5</td>    <td>RAP1</td>                          </tr>
 
−
                                    <tr> <td>6</td>    <td>RAP2</td>                          </tr>
 
−
                                    <tr> <td>7</td>    <td>RAP3</td>                          </tr>
 
−
                                    <tr> <td>8</td>    <td>RAP4 glycerol stock</td>          </tr>
 
−
                                    <tr> <td>9</td>    <td>RAP5</td>                          </tr>
 
−
                                    <tr> <td>10</td>  <td>Transformation 2A</td>            </tr>
 
−
                                    <tr> <td>11</td>  <td>Transformation 2B</td>            </tr>
 
−
                                    <tr> <td>12</td>  <td>Transformation 2C</td>            </tr>
 
−
                                    <tr> <td>13</td>  <td>Transformation 3A</td>            </tr>
 
−
                                    <tr> <td>14</td>  <td>Transformation 3B</td>            </tr>
 
−
                                    <tr> <td>15</td>  <td>Transformation 3C</td>            </tr>
 
−
                                    <tr> <td>16</td>  <td>1kb ladder</td>                    </tr>
 
−
                                </table>
 
−
                                <p>Lanes 2, 3 and 4: loaded with 2&mu;L of PCR reaction + 8&mu;L of dH2O + 2&mu;L of 6x DNA loading dye. Miniprep samples: loaded with 10&mu;L od digest + 6x DNA loading dye.</p>
 
−
                                <h2>In Vitro Transcription</h2>
 
−
                                <p>Performed depending on the quality of PCR samples</p>
 
−
                                <ol>
 
−
                                    <li>Set up reactions
 
−
                                        <table>
 
−
                                            <tr> <th>Components</th> <th>Volume (&mu;L)</th> </tr>
 
−
                                            <tr> <td>MilliQ H20</td> <td>92.1</td> </tr>
 
−
                                            <tr> <td>5x transcription buffer (TraB)</td> <td>60</td> </tr>
 
−
                                            <tr> <td>100 Mm DTT</td> <td>30</td> </tr>
 
−
                                            <tr> <td>25 mM NTPs</td> <td>36</td> </tr>
 
−
                                            <tr> <td>100 mM GMP</td> <td>15</td> </tr>
 
−
                                            <tr> <td>0.5 U/&mu;L iPPase</td> <td>6</td> </tr>
 
−
                                            <tr> <td>T7-RNA-Polymerase</td> <td>30</td> </tr>
 
−
                                            <tr> <td>40 U/&mu;L RNase inhibitor</td> <td>0.9</td> </tr>
 
−
                                            <tr> <td>PCR product</td> <td>30</td> </tr>
 
−
                                        </table>
 
−
                                        Total volume: 300&mu;L
 
−
                                    </li>
 
−
                                    <li>Incubate at 37&deg;C ON and the digest with DNase I for 1 hour at 37&deg;C</li>
 
−
                                </ol>
 
−
                            </div>
 
−
                            <div class="entry_expand_button">
 
−
                                More &darr;
 
−
                            </div>
 
−
                        </div>
 
−
                    </div>
 
−
                    <!-- End Notebook Entry -->
 
−
 
−
                    <!-- Notebook Entry -->
 
−
                    <div class="notebook_entry">
 
−
                        <div class="entry_day">
 
−
                            <div>21</div>
 
−
                        </div>
 
−
                        <div class="entry_content">
 
−
                            <div class="entry_title">
 
−
                                <h1>Transformation</h1>
 
−
                            </div>
 
−
                            <div class="entry_data">
 
−
                                <h2>Retry Transformation of Ligation Reaction 1</h2>
 
−
                                <ol>
 
−
                                    <li>2.88g urea</li>
 
−
                                    <li>1.8 ml polyacrylamide</li>
 
−
                                    <li>1.2 ml 5Xtbe</li>
 
−
                                    <li>Fill to 6ml dH2O</li>
 
−
                                    <li>Dissolve the urea</li>
 
−
                                    <li>Add 8&mu;L TEMED</li>
 
−
                                    <li>50&mu;L APS</li>
 
−
                                </ol>
 
−
                                <h2>Transforming Ligations 1 and 4 - Gel Extraction vs Column purified ligations into DH5&alpha; cells.</h2>
 
−
                                <p>Making 10 mL of 10x TT concentration = 50 mM. Add 0.09008 g of theophylline to 10 mL of dH2O</p>
 
−
                                <p>Reactions tested:</p>
 
−
                                <ul>
 
−
                                    <li>10&mu;L of final volume</li>
 
−
                                    <li>2x</li>
 
−
                                    <li>1&mu;L RNA</li>
 
−
                                    <li>2&mu;L 5x binding buffer</li>
 
−
                                    <li>1&mu;L 50 mM TT</li>
 
−
                                    <li>2X</li>
 
−
                                    <li>1&mu;L RNA</li>
 
−
                                    <li>1&mu;L TAKM7 10x</li>
 
−
                                    <li>1&mu;L 50 mM TT</li>
 
−
                                </ul>
 
−
                                <p>Incubate ON + RT at 37&deg;C</p>
 
−
                            </div>
 
−
                            <div class="entry_expand_button">
 
−
                                More &darr;
 
−
                            </div>
 
−
                        </div>
 
−
                    </div>
 
−
                    <!-- End Notebook Entry -->
 
−
 
−
                    <!-- Notebook Entry -->
 
−
                    <div class="notebook_entry">
 
−
                        <div class="entry_day">
 
−
                            <div>22</div>
 
−
                        </div>
 
−
                        <div class="entry_content">
 
−
                            <div class="entry_title">
 
−
                                <h1>Mass Spectroscopy</h1>
 
−
                            </div>
 
−
                            <div class="entry_data">
 
−
                                <p>RAP OE I 1 hour of LB media under an IPTG inducible promoter. Added 5mL of ON culture to 500ml of culture at 11:20am</p>
 
−
                                <p>At 11:20 added 5ml of ON RAP culture and added 500&mu;L of AMP</p>
 
−
                                <p>At OD = 0.6 add 500&mu;L of IPTG and 500&mu;L of AMP. Also take 1ml sample every hour.<p>
 
−
                                <table>
 
−
                                    <tr> <th>Time</th>  <th>Optical density (OD)</th> </tr>
 
−
                                    <tr> <td>11:20</td> <td>0.00</td>                </tr>
 
−
                                    <tr> <td>12:12</td> <td>0.01</td>                </tr>
 
−
                                    <tr> <td>13:13</td> <td>0.05</td>                </tr>
 
−
                                    <tr> <td>14:30</td> <td>0.20</td>                </tr>
 
−
                                    <tr> <td>15:00</td> <td>0.42</td>                </tr>
 
−
                                    <tr> <td>15:30</td> <td>0.71</td>                </tr>
 
−
                                    <tr> <td>15:38</td> <td>0.75</td>                </tr>
 
−
                                    <tr> <td>16:21</td> <td>1.14</td>                </tr>
 
−
                                    <tr> <td>17:25</td> <td>1.40</td>                </tr>
 
−
                                    <tr> <td>18:56</td> <td>1.64</td>                </tr>
 
−
                                    <tr> <td>19:54</td> <td>1.73</td>                </tr>
 
−
                                    <tr> <td>21:04</td> <td>1.77</td>                </tr>
 
−
                                </table>
 
−
                            </div>
 
−
                            <div class="entry_expand_button">
 
−
                                More &darr;
 
−
                            </div>
 
−
                        </div>
 
−
                    </div>
 
−
                    <!-- End Notebook Entry -->
 
−
 
−
                    <!-- Notebook Entry -->
 
−
                    <div class="notebook_entry">
 
−
                        <div class="entry_day">
 
−
                            <div>27</div>
 
−
                        </div>
 
−
                        <div class="entry_content">
 
−
                            <div class="entry_title">
 
−
                                <h1>Overexpression SDS PAGE</h1>
 
−
                            </div>
 
−
                            <div class="entry_data">
 
−
                                <table>
 
−
                                    <tr> <th>L1</th> <th>PL</th>          </tr>
 
−
                                    <tr> <td>2</td>  <td>Time point 0</td> </tr>
 
−
                                    <tr> <td>3</td>  <td>Time point 1</td> </tr>
 
−
                                    <tr> <td>4</td>  <td>Time point 2</td> </tr>
 
−
                                    <tr> <td>5</td>  <td>Time point 3</td> </tr>
 
−
                                    <tr> <td>6</td>  <td>Time point 4</td> </tr>
 
−
                                    <tr> <td>7</td>  <td>Time point 5</td> </tr>
 
−
                                </table>
 
−
                            </div>
 
−
                            <div class="entry_expand_button">
 
−
                                More &darr;
 
−
                            </div>
 
−
                        </div>
 
−
                    </div>
 
−
                    <!-- End Notebook Entry -->
 
−
 
−
                    <!-- Notebook Entry -->
 
−
                    <div class="notebook_entry">
 
−
                        <div class="entry_day">
 
−
                            <div>28</div>
 
−
                        </div>
 
−
                        <div class="entry_content">
 
−
                            <div class="entry_title">
 
−
                                <h1>PCR, Digests &amp; Ligation</h1>
 
−
                            </div>
 
−
                            <div class="entry_data">
 
−
                                <h1>Digest pSBIC3 and Insert our MS2 Coding Sequence</h1>
 
−
                                <table>
 
−
                                    <tr> <th>Component</th>          <th>Volume (μL)</th> </tr>
 
−
                                    <tr> <td>pSCBIC3-RFP</td>        <td>10</td>          </tr>
 
−
                                    <tr> <td>Cutsmart buffer 10x</td> <td>2</td>          </tr>
 
−
                                    <tr> <td>EcoRI</td>              <td>1</td>          </tr>
 
−
                                    <tr> <td>PstI</td>                <td>1</td>          </tr>
 
−
                                    <tr> <td>dH2O</td>                <td>7</td>          </tr>
 
−
                                </table>
 
−
                                <p>Total volume: 20&mu;L</p>
 
−
                                <ul>
 
−
                                    <li>1 hour incubation</li>
 
−
                                    <li>1.0&mu;L Rsap</li>
 
−
                                </ul>
 
−
                                <h2>PCR</h2>
 
−
                                <table>
 
−
                                    <tr> <th>Component</th>                      <th>Volume (&mu;L)</th> </tr>
 
−
                                    <tr> <td>10x PCR reaction buffer</td>        <td>10</td>            </tr>
 
−
                                    <tr> <td>DNA template RNAP3</td>              <td>0.5</td>            </tr>
 
−
                                    <tr> <td>10mM dNTPs</td>                      <td>4</td>              </tr>
 
−
                                    <tr> <td>Forward primer &rarr; BB prefix</td> <td>2</td>              </tr>
 
−
                                    <tr> <td>Reverse primer &rarr; BB suffix</td> <td>2</td>              </tr>
 
−
                                    <tr> <td>MilliQ dH2O</td>                    <td>80.5</td>          </tr>
 
−
                                    <tr> <td>Pfu DNA polymerase</td>              <td>1</td>              </tr>
 
−
                                </table>
 
−
                                <p>Total volume: 100&mu;L</p>
 
−
                                <p>PCR programme is pJET</p>
 
−
                                <h2>Construct Digest</h2>
 
−
                                <table>
 
−
                                    <tr> <th>Component</th>          <th>Volume (&mu;L)</th> </tr>
 
−
                                    <tr> <td>Construct</td>          <td>10</td>            </tr>
 
−
                                    <tr> <td>Cutsmart buffer 10x</td> <td>2</td>              </tr>
 
−
                                    <tr> <td>EcoRI</td>              <td>1</td>              </tr>
 
−
                                    <tr> <td>PsfI</td>                <td>1</td>              </tr>
 
−
                                    <tr> <td>dH2O</td>                <td>7</td>              </tr>
 
−
                                </table>
 
−
                                <p>Total volume: 20&mu;L</p>
 
−
                                <p>1 hour incubation</p>
 
−
                                <h2>Ligation Reaction</h2>
 
−
                                <table>
 
−
                                    <tr> <th>Component</th>            <th>Volume (&mu;L)</th> </tr>
 
−
                                    <tr> <td>T4 DNA ligase buffer</td> <td>1</td>              </tr>
 
−
                                    <tr> <td>T4 DNA ligase</td>        <td>0.5</td>            </tr>
 
−
                                    <tr> <td>pSBIC3 backbone</td>      <td>1</td>              </tr>
 
−
                                    <tr> <td>Construct</td>            <td>1</td>              </tr>
 
−
                                    <tr> <td>dH2O</td>                <td>6.5</td>            </tr>
 
−
                                </table>
 
−
                                <p>Total volume: 10&mu;L</p>
 
−
                                <p>Construct =  173.5&mu;g/ml</p>
 
−
                                <p>Vector = 7.520&mu;g/ml</p>
 
−
                                <p>Incubation overnight at room temperature</p>
 
−
                            </div>
 
−
                            <div class="entry_expand_button">
 
−
                                More &darr;
 
−
                            </div>
 
−
                        </div>
 
−
                    </div>
 
−
                    <!-- End Notebook Entry -->
 
−
 
−
                    <!-- Notebook Entry -->
 
−
                    <div class="notebook_entry">
 
−
                        <div class="entry_day">
 
−
                            <div>29</div>
 
−
                        </div>
 
−
                        <div class="entry_content">
 
−
                            <div class="entry_title">
 
−
                                <h1>Sequencing and Transformation</h1>
 
−
                            </div>
 
−
                            <div class="entry_data">
 
−
                                <h2>Sequencing</h2>
 
−
                                <table>
 
−
                                    <tr> <th>Sample</th> <th>Transformation Number</th> </tr>
 
−
                                    <tr> <td>01</td>    <td>2A</td>                    </tr>
 
−
                                    <tr> <td>02</td>    <td>2B</td>                    </tr>
 
−
                                    <tr> <td>03</td>    <td>3A</td>                    </tr>
 
−
                                    <tr> <td>04</td>    <td>3B</td>                    </tr>
 
−
                                    <tr> <td>05</td>    <td>2A</td>                    </tr>
 
−
                                    <tr> <td>06</td>    <td>2B</td>                    </tr>
 
−
                                    <tr> <td>07</td>    <td>3A</td>                    </tr>
 
−
                                    <tr> <td>08</td>    <td>3B</td>                    </tr>
 
−
                                </table>
 
−
                                <h2>Transformation of ligation reactions 1 (at 16&deg;C), 4 and construct + vector (L1)</h2>
 
−
                                <p>Protocol:</p>
 
−
                                <ol>
 
−
                                    <li>Add 1&mu;L of DNA to 25&mu;L of competent cells</li>
 
−
                                    <li>Incubate for 30 minutes on ice</li>
 
−
                                    <li>Heat shock at 47&deg;C for 45 seconds</li>
 
−
                                    <li>Incubate on ice for 5 minutes</li>
 
−
                                    <li>Add 400&mu;L of LB</li>
 
−
                                    <li>Incubate in RNA common room at 37&deg;C for an hour</li>
 
−
                                    <li>Plate 400&mu;L</li>
 
−
                                </ol>
 
−
                            </div>
 
−
                            <div class="entry_expand_button">
 
−
                                More &darr;
 
−
                            </div>
 
−
                        </div>
 
−
                    </div>
 
−
                    <!-- End Notebook Entry -->
 
−
 
−
                </div>
 
−
 
−
            </div>
 
−
 
−
        </div>
 
−
 
−
    </body>
 
−
</html>
 

Latest revision as of 02:36, 17 September 2015