Difference between revisions of "Team:Oxford/Test/Notebook"

Line 2: Line 2:
  
 
<html>
 
<html>
−
<div class="container-fluid page-heading">
+
    <div class="container-fluid page-heading">
−
    <h3>Notebook</h3>
+
        <h3>Notebook</h3>
−
</div>
+
    </div>
−
<div class="container-fluid">
+
    <div class="container-fluid">
−
    <div class="row">
+
        <div class="row">
−
        <div class="col-md-9">
+
            <div class="col-md-9">
−
            <div class="section" id="week-1">
+
 
                 <div class="slim">
 
                 <div class="slim">
−
                     <h2>Week 1</h2>
+
                     <div class="section" id="cloning">
−
                    <div class="section" id="week-1-day-1">
+
                        <h2>Cloning</h2>
−
                        <h3>Week 1 - Day 1</h3>
+
                        <div class="section" id="1">
−
                        <div class="section" id="week-1-day-1-preparation-of-stock-solutions">
+
                            <h3>Week 1</h3>
−
                            <h4>Preparation of Stock Solutions</h4>
+
                            <div id="1-1">
−
                            <ol>
+
                                <h4>Week 1 - Day 1</h4>
−
                                <li>
+
                                <div id="1-1-prep-stock">
−
                                    <h4>gBlocks</h4>
+
                                    <h5>Preparation of Stock Solutions</h5>
 +
                                    <ol>
 +
                                        <li>
 +
                                            <h5>gBlocks</h5>
 +
                                            <p>
 +
                                                The gBlocks ordered from IDT arrived in the form of vials of 200\(\mu\)g solid DNA powder.
 +
                                            </p>
 +
                                            <p>
 +
                                                (refer to BioBricks page for information on DNA sequences)
 +
                                            </p>
 +
                                            <p>
 +
                                                The gBlocks were made into 10ng/µl stock solutions in Milli-Q water for storage:
 +
                                            </p>
 +
                                            <table border="1">
 +
                                                <tr>
 +
                                                    <th>mass/ng</th>
 +
                                                    <th>conc/ng\(\mu\)l<sup>-1</sup></th>
 +
                                                    <th>final volume\(\mu\)l</th>
 +
                                                </tr>
 +
                                                <tr>
 +
                                                    <td>200</td>
 +
                                                    <td>10</td>
 +
                                                    <td>20</td>
 +
                                                </tr>
 +
                                            </table>
 +
                                        </li>
 +
                                        <li>
 +
                                            <h5>Primers</h5>
 +
                                            <p>
 +
                                                The forward and reverse primers ordered from IDT came in 32.4nmol and 34.3nmol of solid respectively.
 +
                                            </p>
 +
                                            <ul>
 +
                                                <h6>Sequences</h6>
 +
                                                <li>Forward - CTTTTTTGCCGGACTGC</li>
 +
                                                <li>Reverse - ATGATTTCTGGAATTCGC</li>
 +
                                            </ul>
 +
                                        </li>
 +
                                    </ol>
 
                                     <p>
 
                                     <p>
−
                                         The gBlocks ordered from IDT arrived in the form of vials of 200ng solid DNA powder.
+
                                         The primers were made into 100µM stock solutions in Milli-Q water for storage:
 
                                     </p>
 
                                     </p>
 +
                                    <table border="1">
 +
                                        <tr>
 +
                                            <th>amt/10<sup>-9</sup>mol</th>
 +
                                            <th>conc/10<sup>-6</sup>M</th>
 +
                                            <th>final volume/10<sup>-6</sup>L</th>
 +
                                        </tr>
 +
                                        <tr>
 +
                                            <td>32.4</td>
 +
                                            <td>100</td>
 +
                                            <td>324</td>
 +
                                        </tr>
 +
                                        <tr>
 +
                                            <td>34.3</td>
 +
                                            <td>100</td>
 +
                                            <td>343</td>
 +
                                        </tr>
 +
                                    </table>
 +
                                </div>
 +
                                <div id="1-1-prep-reaction">
 +
                                    <h4>Preparation of Reaction Solutions</h4>
 +
                                    <ol>
 +
                                        <li>
 +
                                            <h5>gBlocks</h5>
 +
                                            <p>
 +
                                                2\(\mu\)l of each stock solution were diluted in Milli-Q water to achieve final solution volumes of 20\(\mu\)l to make 1ng/\(\mu\)l<sup>-1</sup>
 +
                                            </p>
 +
                                        </li>
 +
                                        <h5>Primers</h5>
 +
                                        <p>
 +
                                            2\(\mu\)l of each stock solution were diluted in Milli-Q water to achieve final solution volumes of 20\(\mu\)l to make 10\(\mu\)M reaction solutions.(The solutions are labelled as "Prefix primer" and "suffix primer" in eppendorf tubes in the fridge)
 +
                                        </p>
 +
                                    </ol>
 +
                                </div>
 +
                                <div id="1-1-pcr">
 +
                                    <h4>Polymerase Chain Reaction</h4>
 
                                     <p>
 
                                     <p>
−
                                         (refer to BioBricks page for information on DNA sequences)
+
                                         25µl reactions were run according to the PCR protocol here
 
                                     </p>
 
                                     </p>
 
                                     <p>
 
                                     <p>
−
                                         The gBlocks were made into 10ng/µl stock solutions in Milli-Q water for storage:
+
                                         * The final concentrations of the primers were noted as they are needed to determine the annealing temperatures for the primers, which can be done using NEB’s online tool <a href="http://tmcalculator.neb.com/#!/">here.</a>
−
                                        <table border="1">
+
−
                                            <tr>
+
−
                                                <th>mass/ng</th>
+
−
                                                <th>conc/ng\(\mu\)l<sup>-1</sup></th>
+
−
                                                <th>final volume\(\mu\)l</th>
+
−
                                            </tr>
+
−
                                            <tr>
+
−
                                                <td>200</td>
+
−
                                                <td>10</td>
+
−
                                                <td>20</td>
+
−
                                            </tr>
+
−
                                        </table>
+
 
                                     </p>
 
                                     </p>
−
                                </li>
 
−
                                <li>
 
−
                                    <h4>Primers</h4>
 
 
                                     <p>
 
                                     <p>
−
                                         The forward and reverse primers ordered from IDT came in 32.4nmol and 34.3nmol of solid respectively.
+
                                         ** Add components in order of decreasing volume for maximum ease-of-pipetting.
 
                                     </p>
 
                                     </p>
 
                                     <p>
 
                                     <p>
−
                                         (Sequences:
+
                                         *** When reaction mixture is being made up, all components as well as the mixture itself are to be kept on ice, as the Master Mix is a high-fidelity polymerase that will recognize the primers as being incorrectly base-paired and be able to hydrolyse the primers if kept at room temperature.
−
                                        Forward - CTTTTTTGCCGGACTGC
+
−
                                        Reverse - ATGATTTCTGGAATTCGC)
+
 
                                     </p>
 
                                     </p>
 
                                     <p>
 
                                     <p>
−
                                         The primers were made into 100µM stock solutions in Milli-Q water for storage:
+
                                         **** Use Q5 enzyme in the cold room to avoid defrosting and freezing the original stock of Q5 enzyme. This could decrease the activity of Q5 enzyme. Bring ice bucket to the cold room to bring Q5 into the bench.
−
                                        <table border="1">
+
                                    </p>
−
                                            <tr>
+
                                    <p>
−
                                                <th>amt/10<sup>-9</sup>mol</th>
+
                                        ***** Make sure that the primer and small amounts of DNA and primer doesn’t stick onto the side of the tube or the tip.
−
                                                <th>conc/10<sup>-6</sup>M</th>
+
                                    </p>
−
                                                <th>final volume/10<sup>-6</sup>L</th>
+
                                    <p>
−
                                            </tr>
+
                                        The reaction mixture tubes were positioned in an Eppendorf Mastercycler nexus X2 and the PCR program was run.
−
                                            <tr>
+
                                    </p>
−
                                                <td>32.4</td>
+
                                    <p>
−
                                                <td>100</td>
+
                                        * DNA denaturation can be performed at 98℃ because of the high thermal stability of the Q5 polymerase
−
                                                <td>324</td>
+
                                    </p>
−
                                            </tr>
+
                                    <p>
−
                                            <tr>
+
                                         ** A PCR takes 20-30 seconds to extend a sequence by 1kb, and since our longest sequence is ~2kb the extension time was determined to be 60s per cycle.
−
                                                <td>34.3</td>
+
−
                                                <td>100</td>
+
−
                                                <td>343</td>
+
−
                                            </tr>
+
−
                                         </table>
+
 
                                     </p>
 
                                     </p>
−
                                </li>
 
−
                            </ol>
 
−
                            <div class="section" id="week-1-day-1-preparation-of-reaction-solutions">
 
−
                                <h4>Preparation of Reaction Solutions</h4>
 
−
                                <ol>
 
−
                                    <li>
 
−
                                        <h4>gBlocks</h4>
 
−
                                        <p>
 
−
                                            2\(\mu\)l of each stock solution were diluted in Milli-Q water to achieve final solution volumes of 20\(\mu\)l to make 1ng/\(\mu\)l<sup>-1</sup>
 
−
                                        </p>
 
−
                                    </li>
 
−
                                    <li>
 
−
                                        <h4>Primers</h4>
 
−
                                        <p>
 
−
                                            2\(\mu\)l of each stock solution were diluted in Milli-Q water to achieve final solution volumes of 20\(\mu\)l to make 10\(\mu\)M reaction solutions.(The solutions are labelled as "Prefix primer" and "suffix primer" in eppendorf tubes in the fridge)
 
−
                                        </p>
 
−
                                    </li>
 
−
                                </ol>
 
−
                            </div>
 
−
                            <div class="section" id="week-1-day-1-polymerase-chain-reaction-set-up">
 
−
                                <h4>Polymerase Chain Reaction Set-Up</h4>
 
−
                                <div class="image image-right">
 
−
                                    <img src="https://static.igem.org/mediawiki/2015/b/bb/Ox_Day1Mabel.JPG" />
 
−
                                    <p>Mabel pipetting</p>
 
 
                                 </div>
 
                                 </div>
−
                                 <p>
+
                                 <div id="1-1-gel">
−
                                    The protocol for running a PCR using NEB's Q5 High-Fidelity 2X Master Mix can be found <a href="https://www.neb.com/protocols/2012/08/29/protocol-for-q5-high-fidelity-2x-master-mix-m0492">here.</a>
+
                                     <h4>Gel Electrophoresis of PCR-Amplified gBlocks</h4>
−
                                </p>
+
                                    <p>
−
                                <p>
+
                                         An agarose gel was prepared according to the agarose prepartion protocol.
−
                                    25\(\mu\)l reactions were run, with the volume breakdown by component being:
+
                                     </p>
−
                                     <table border="1">
+
                                    <p>
−
                                        <tr>
+
                                        DNA preparation:
−
                                            <th>Component</th>
+
                                    </p>
−
                                            <th>Volume/\(\mu\)l</th>
+
                                    <p>
−
                                            <th>Final conc/nM</th>
+
                                        The contents of the PCR tubes need to be stained with a loading dye to help visualize its migration.
−
                                        </tr>
+
                                     </p>
−
                                        <tr>
+
                                     <p>
−
                                            <td>Q5 HF Master Mix</td>
+
                                         To each 25\(\mu\)l of content in each PCR tube, 10\(\mu\)l of blue loading dye was added.
−
                                            <td>12.5</td>
+
                                     </p>
−
                                            <td>-</td>
+
−
                                        </tr>
+
−
                                         <tr>
+
−
                                            <td>10\(\mu\)M Forward Primer</td>
+
−
                                            <td>1.25</td>
+
−
                                            <td>500</td>
+
−
                                        </tr>
+
−
                                        <tr>
+
−
                                            <td>10\(\mu\)M Reverse Primer</td>
+
−
                                            <td>1.25</td>
+
−
                                            <td>500</td>
+
−
                                        </tr>
+
−
                                        <tr>
+
−
                                            <td>1ng/\(\mu\)l<sup>-1</sup></td>
+
−
                                            <td>1.0</td>
+
−
                                            <td>-</td>
+
−
                                        </tr>
+
−
                                        <tr>
+
−
                                            <td>Milli-Q Water</td>
+
−
                                            <td>9.0></td>
+
−
                                            <td>-</td>
+
−
                                        </tr>
+
−
                                     </table>
+
−
                                </p>
+
−
                                <p>
+
−
                                    * The final concentrations of the primers were noted as they are needed to determine the annealing temperatures for the primers, which can be done using NEB’s online tool <a href="http://tmcalculator.neb.com/#!/">here.</a>
+
−
                                </p>
+
−
                                <p>
+
−
                                    ** Add components in order of decreasing volume for maximum ease-of-pipetting.
+
−
                                </p>
+
−
                                <p>
+
−
                                    *** When reaction mixture is being made up, all components as well as the mixture itself are to be kept on ice, as the Master Mix is a high-fidelity polymerase that will recognize the primers as being incorrectly base-paired and be able to hydrolyse the primers if kept at room temperature.
+
−
                                </p>
+
−
                                <p>
+
−
                                     **** Use Q5 enzyme in the cold room to avoid defrosting and freezing the original stock of Q5 enzyme. This could decrease the activity of Q5 enzyme. Bring ice bucket to the cold room to bring Q5 into the bench.
+
−
                                </p>
+
−
                                <p>
+
−
                                     ***** Make sure that the primer and small amounts of DNA and primer doesn’t stick onto the side of the tube or the tip.
+
−
                                </p>
+
−
                                <p>
+
−
                                    The reaction mixture tubes were positioned in an Eppendorf Mastercycler nexus X2 and the following PCR program was run:
+
−
                                    <table border='1'>
+
−
                                         <tr>
+
−
                                            <th>Cycle(s)</th>
+
−
                                            <th>Step</th>
+
−
                                            <th>Temp/℃</th>
+
−
                                            <th>Time/s</th>
+
−
                                        </tr>
+
−
                                        <tr>
+
−
                                            <td>1</td>
+
−
                                            <td>Initial DNA Melting</td>
+
−
                                            <td>98</td>
+
−
                                            <td>30</td>
+
−
                                        </tr>
+
−
                                        <tr>
+
−
                                            <td>25-35</td>
+
−
                                        </tr>
+
−
                                    </table>
+
−
                                    <!--Finish Table-->
+
−
 
+
−
                                </p>
+
−
                                <p>
+
−
                                    * DNA denaturation can be performed at 98℃ because of the high thermal stability of the Q5 polymerase
+
−
                                </p>
+
−
                                <p>
+
−
                                    ** A PCR takes 20-30 seconds to extend a sequence by 1kb, and since our longest sequence is ~2kb the extension time was determined to be 60s per cycle.
+
−
                                </p>
+
−
                            </div>
+
−
                            <div class="section" id="week-1-day-1-gel-electrophoresis-of-pcr-amplified-gblocks">
+
−
                                <h4>Gel Electrophoresis of PCR-Amplified gBlocks</h4>
+
−
                                <div class="image image-left">
+
−
                                     <img src="https://static.igem.org/mediawiki/2015/d/dc/Ox_Day1Leon.JPG" />
+
−
                                    <p>Leon pouring the gel</p>
+
 
                                 </div>
 
                                 </div>
−
                                <p>General guidelines for agarose preparation
 
−
                                    <table border="1">
 
−
                                        <tr>
 
−
                                            <th>Fragment size</th>
 
−
                                            <th>Agarose gel w/v %</th>
 
−
                                            <th>Mass of agarose in 200ml 0.5x TBE / g</th>
 
−
                                        </tr>
 
−
                                        <tr>
 
−
                                            <td>>3kb</td>
 
−
                                            <td>0.8</td>
 
−
                                            <td>1.6</td>
 
−
                                        </tr>
 
−
                                        <tr>
 
−
                                            <td><1kb</td>
 
−
                                            <td>2</td>
 
−
                                            <td>4</td>
 
−
                                        </tr>
 
−
                                        <tr>
 
−
                                            <td>In between</td>
 
−
                                            <td>1</td>
 
−
                                            <td>2</td>
 
−
                                        </tr>
 
−
                                    </table>
 
−
                                    <h4>Agarose Preparation Protocol</h4>
 
−
                                    <ol>
 
−
                                        <li>Heat 2g agarose in 200ml 0.5x TBE for 2 minutes under full power in the microwave (use a 500mL Duran bottle, and place a weighing boat underneath it to prevent the causing of a mess in the event the mixture boils over; DO NOT fully tighten the Duran cap).</li>
 
−
                                        <li>Check if the agarose has been fully dissolved. Heat it further if gel strands are visible.</li>
 
−
                                        <li>Leave the agarose solution to cool at 50℃ for 20 minutes.</li>
 
−
                                        <li>Pour agarose onto gel plate in a setting tray with appropriately-sized combs already fixed onto it, and leave for 20 minutes to let it set.</li>
 
−
                                        <li>When the agarose has set, remove the combs and transfer the gel plate from the setting tray to the electrophoresis chamber.</li>
 
−
                                        <li>Flood the gel plate with 0.5x TBE buffer up until right above the top of the wells.</li>
 
−
                                        <li>The gel should be positioned such that the positive (red) electrode is on the far side of the gel from the wells, as the negatively-charged DNA will migrate towards the positive electrode.</li>
 
−
                                    </ol>
 
−
                                </p>
 
−
                                <p>
 
−
                                    DNA preparation:
 
−
                                </p>
 
−
                                <p>
 
−
                                    The contents of the PCR tubes need to be stained with a loading dye to help visualize its migration.
 
−
                                </p>
 
−
                                <p>
 
−
                                    To each 25\(\mu\)l of content in each PCR tube, 10\(\mu\)l of blue loading dye was added.
 
−
                                </p>
 
 
                             </div>
 
                             </div>
−
                        </div>
 
−
                    </div>
 
−
                    <div class="section" id="week-1-day-2">
 
−
                        <h3>Week 1 Day 2</h3>
 
−
                        <div class="section" id="week-1-day-2-gel-electrophoresis-of-pcr-amplified-gblocks-continued">
 
−
                            <h4>Gel Electrophoresis of PCR-Amplified gBlocks Continued</h4>
 
−
                            <p>
 
−
                                gBlock sizes for reference:
 
−
                                <table border="1">
 
−
                                    <tr>
 
−
                                        <th>Label</th>
 
−
                                        <th>Construct</th>
 
−
                                        <th>Size/bp</th>
 
−
                                    </tr>
 
−
                                    <tr>
 
−
                                        <td>A</td>
 
−
                                        <td>LasR Holin</td>
 
−
                                        <td>1763</td>
 
−
                                    </tr>
 
−
                                    <tr>
 
−
                                        <td>B</td>
 
−
                                        <td>LasR sfGFP</td>
 
−
                                        <td>1829</td>
 
−
                                    </tr>
 
−
                                    <tr>
 
−
                                        <td>C</td>
 
−
                                        <td>Lsr sfGFP</td>
 
−
                                        <td>910</td>
 
−
                                    </tr>
 
−
                                    <tr>
 
−
                                        <td>D</td>
 
−
                                        <td>Lsr Holin</td>
 
−
                                        <td>862</td>
 
−
                                    </tr>
 
−
                                    <tr>
 
−
                                        <td>E</td>
 
−
                                        <td>DNase DsbA</td>
 
−
                                        <td>646</td>
 
−
                                    </tr>
 
−
                                    <tr>
 
−
                                        <td>F</td>
 
−
                                        <td>DspB YebF</td>
 
−
                                        <td>1525</td>
 
−
                                    </tr>
 
−
                                    <tr>
 
−
                                        <td>G</td>
 
−
                                        <td>DspB</td>
 
−
                                        <td>1174</td>
 
−
                                    </tr>
 
−
                                    <tr>
 
−
                                        <td>H</td>
 
−
                                        <td>MccS</td>
 
−
                                        <td>448</td>
 
−
                                    </tr>
 
−
                                    <tr>
 
−
                                        <td>I</td>
 
−
                                        <td>DspB Fla</td>
 
−
                                        <td>1336</td>
 
−
                                    </tr>
 
−
                                    <tr>
 
−
                                        <td>J</td>
 
−
                                        <td>DspB DsbA</td>
 
−
                                        <td>1228</td>
 
−
                                    </tr>
 
−
                                    <tr>
 
−
                                        <td>K</td>
 
−
                                        <td>Art-175 DsbA</td>
 
−
                                        <td>1012</td>
 
−
                                    </tr>
 
−
                                    <tr>
 
−
                                        <td>L</td>
 
−
                                        <td>Art-175 YebF</td>
 
−
                                        <td>1309</td>
 
−
                                    </tr>
 
−
                                    <tr>
 
−
                                        <td>M</td>
 
−
                                        <td>Art-E</td>
 
−
                                        <td>644</td>
 
−
                                    </tr>
 
−
                                    <tr>
 
−
                                        <td>N</td>
 
−
                                        <td>Art-175 Fla</td>
 
−
                                        <td>1120</td>
 
−
                                    </tr>
 
−
                                </table>
 
−
                            </p>
 
−
                            <p>
 
−
                                Lane 1: 10\(\mu\)l of <a href="#https://www.neb.com/products/n0550-quick-load-purple-2-log-dna-ladder-0-1-10-0-kb">2-Log Ladder</a>
 
−
                            </p>
 
−
                            <p>
 
−
                                Lanes 2-15: 20\(\mu\)l of DNA and loading dye mixture prepared on <a href="#week-1-day-1-gel-electrophoresis-of-pcr-amplified-gblocks">22/06</a>
 
−
                            </p>
 
−
                            <p>
 
−
                                A potential difference of 120V was applied across the electrodes (the higher the voltage, the faster the gel will run but the poor the separation will be; DNA separation is typically done in the 120-140V range) for 80 minutes. As long as DNA has passed ⅔ of the column or purple dye have passed purple area of the gel, the gel is ready to get into the EtBr.
 
−
                            </p>
 
−
                            <p>
 
−
                                Stain gel using ethidium bromide according to the following protocol:
 
−
                                <ol>
 
−
                                    <li>Pick up the gel keeping it flat</li>
 
−
                                    <li>Slide carefully into a vat of ethidium bromide</li>
 
−
                                    <li>Set the vat to gentle shaking for 30 minutes</li>
 
−
                                    <li>Pick up the gel using a spatula and rinse off the toxic ethidium bromide</li>
 
−
                                    <li>Visualise using transilluminator</li>
 
−
                                </ol>
 
−
                            </p>
 
−
                            <p>
 
−
                                Ethidium bromide stains DNA such that it fluoresces with an orange colour under UV light.
 
−
                            </p>
 
−
                        </div>
 
−
                        <div class="section" id="week-1-day-2-visualizing-separated-dna-in-agarose">
 
−
                            <h4>Visualizing Separated DNA in Agarose - UV Transilluminator</h4>
 
−
                            <ol>
 
−
                                <li>Place the gel on the transilluminator stage and adjust stage height appropriately.</li>
 
−
                                <li>Set the transilluminator using the GeneSnap program such that the light emitted is UV (instead of white light) and the software filter is configured to pick up EtBr fluorescence.</li>
 
−
                                <li>Adjust the contrast such that the bands can be clearly seen.</li>
 
−
                                <li>Adjust the focus using the focusing rings to sharpen the image.</li>
 
−
                                <li>Save the image in the naming format “dd_mm_yy” to Disk C: → Lab users → iGEM in .sdg file format, and additionally export it as a .tif file.</li>
 
−
                            </ol>
 
−
                            <p>
 
−
                                Results:
 
−
                            </p>
 
−
                            <div class="image image-left">
 
−
                                <img src="https://static.igem.org/mediawiki/2015/3/3d/Ox_23_6_15_PCR.jpg" />
 
−
                                <p>PCR Results</p>
 
−
                            </div>
 
−
                            <p>
 
−
                                The 7 bands corresponding to expected DNA sizes were excised using a razor blade for cleaning and extraction. The other sequences, along with J which only showed a very weak band, will be re-PCRed under modified conditions at a later date.
 
−
                            </p>
 
−
                            <p>
 
−
                                The excised gel chunks were transferred to centrifugation tubes.
 
−
                            </p>
 
−
                        </div>
 
−
                        <div class="section" id="week-1-day-2-extraction-of-dna-pcr-product-from-agarose-gel">
 
−
                            <h3>Extraction of DNA(PCR product) from Agarose Gel</h3>
 
−
                            <p>
 
−
                                The extraction was performed using the E.Z.N.A. Gel Extraction Kit made by Omega Biotek, according to the <a href="#http://omegabiotek.com/store/wp-content/uploads/2014/01/D2500.D2501-Gel-Extraction-Kit-Combo-Online.pdf">Spin Protocol. </a>
 
−
                            </p>
 
−
                            <p>
 
−
                                The excised agarose chunks needed to be dissolved in a minimum of 1mL of XP2 Binding Buffer per gram of gel. The heaviest chunk of gel weighed 0.16g and as such 160µl of buffer was added to each tube.
 
−
                            </p>
 
−
                            <p>
 
−
                                * As the tubes were spun with their lids open, they were placed such that lids pointed away from the direction of spinning.
 
−
                            </p>
 
−
                        </div>
 
−
                        <div class="section" id="week-1-day-2-restriction-digest-of-extracted-pcr-product">
 
−
                            <h3>Restriction Digest of Extracted PCR product</h3>
 
−
                            <p>
 
−
                                Restriction digest was performed using EcoRI-HF (5’) and SpeI (3’) restriction enzymes.
 
−
                            </p>
 
−
                            <p>
 
−
                                NEB’s Double Digest <a href="#https://www.neb.com/tools-and-resources/interactive-tools/double-digest-finder">Finder</a>was invoked and it was determined that CutSmart Buffer would be used for the digest.
 
−
                            </p>
 
−
                            <p>
 
−
                                The buffer was completely defrosted and shaken before use.
 
−
                            </p>
 
−
                            <p>
 
−
                                There is a recommended digestion protocol on <a href="#http://nebcloner.neb.com/#!/protocol/re/double/EcoRI-HF,SpeI">NEBCloner.</a> 50µL reaction mixtures were set up with component volumes as recommended, except for the DNA where all 30µL of the extraction mixture (in elution buffer) were used in the digest. There would be up to 50ng of DNA in each tube of extraction mixture (from the gel bands).
 
−
                            </p>
 
−
                            <table border="1">
 
−
                                <tr>
 
−
                                    <th>Component</th>
 
−
                                    <th>Volume/\(\mu\)l</th>
 
−
                                </tr>
 
−
                                <tr>
 
−
                                    <td>DNA</td>
 
−
                                    <td>30</td>
 
−
                                </tr>
 
−
                                <tr>
 
−
                                    <td>CutSmart Buffer **must refer to master table</td>
 
−
                                    <td>5</td>
 
−
                                </tr>
 
−
                                <tr>
 
−
                                    <td>EcoRI-HF</td>
 
−
                                    <td>0.5</td>
 
−
                                </tr>
 
−
                                <tr>
 
−
                                    <td>SpeI</td>
 
−
                                    <td>0.5</td>
 
−
                                </tr>
 
−
                                <tr>
 
−
                                    <td>Milli-Q Water</td>
 
−
                                    <td>14</td>
 
−
                                </tr>
 
−
                            </table>
 
−
                            <p>
 
−
                                Incubation at 37℃ was also done for 2 hours (ThermoMixer program 3) instead of the recommended 5-15 minutes, with shaking at 300rpm.
 
−
                            </p>
 
−
                        </div>
 
−
                        <div class="section" id="week-1-day-2-restriction-enzyme-digest-of-the-igem-hq-linearised-psb-1c3">
 
−
                            <h3>Restriction Enzyme Digest of the iGEM HQ linearised pSB-1c3</h3>
 
−
                            <p>
 
−
                                125ng of pSB-1C3 was dissolved in 5mL Milli-Q water
 
−
                            </p>
 
−
                            <p>
 
−
                                The digest was performed using the modified NEBCloner protocol:
 
−
                            </p>
 
−
                            <table border="1">
 
−
                                <tr>
 
−
                                    <th>Component</th>
 
−
                                    <th>Volume/\(\mu\)l</th>
 
−
                                </tr>
 
−
                                <tr>
 
−
                                    <td>Plasmid Backbone</td>
 
−
                                    <td>5</td>
 
−
                                </tr>
 
−
                                <tr>
 
−
                                    <td>CutSmart Buffer **must refer to master table</td>
 
−
                                    <td>5</td>
 
−
                                </tr>
 
−
                                <tr>
 
−
                                    <td>EcoRI-HF</td>
 
−
                                    <td>1</td>
 
−
                                </tr>
 
−
                                <tr>
 
−
                                    <td>SpeI</td>
 
−
                                    <td>1</td>
 
−
                                </tr>
 
−
                                <tr>
 
−
                                    <td>Milli-Q Water</td>
 
−
                                    <td>38</td>
 
−
                                </tr>
 
−
                            </table>
 
−
                            <p>
 
−
                                * We did not add phosphatase because it is assumed that with different sticky ends the vector cannot religate
 
−
                            </p>
 
−
                        </div>
 
−
                        <div class="section" id="week-1-day-2-dna-cleanup-using-ezna-enzymatic-reaction-kit">
 
−
                            <h3>DNA ‘Cleanup’ using EZNA enzymatic reaction kit</h3>
 
−
                            <p>
 
−
                                Protocol can be found at the end of EZNA gel extraction kit
 
−
                            </p>
 
−
                            <p>
 
−
                                Upon completion of restriction digest incubation, the gBlocks and the plasmid backbones were purified again using the E.Z.N.A. Gel Extraction Kit. PCR products and plasmid backbones need to be purified in order to remove remaining impurities including agarose gel and restriction enzymes. At the elution step, the gBlock inserts were eluted using 30µL elution buffer whereas the plasmid backbone was eluted using 50µL of it.
 
−
                            </p>
 
−
                        </div>
 
−
                        <div class="section" id="week-1-day-2-dna-quantification-using-nanodrop">
 
−
                            <h3>DNA ‘Cleanup’ using EZNA enzymatic reaction kit</h3>
 
−
                            <p>
 
−
                                1\(\mu\)L water and tissue were first used to clean the stage. A blank reading was made using 1\(\mu\)L of elution buffer, and 1\(\mu\)L of each sample was measured for concentration:
 
−
                            </p>
 
−
                            <table border="1">
 
−
                                <tr>
 
−
                                    <th>Sample</th>
 
−
                                    <th>Concentration/ng\(\mu\)l</th>
 
−
                                </tr>
 
−
                                <tr>
 
−
                                    <td>C</td>
 
−
                                    <td>11.3</td>
 
−
                                </tr>
 
−
                                <tr>
 
−
                                    <td>D</td>
 
−
                                    <td>3.5</td>
 
−
                                </tr>
 
−
                                <tr>
 
−
                                    <td>E</td>
 
−
                                    <td>0.8</td>
 
−
                                </tr>
 
−
                                <tr>
 
−
                                    <td>H</td>
 
−
                                    <td>0.9</td>
 
−
                                </tr>
 
−
                                <tr>
 
−
                                    <td>J</td>
 
−
                                    <td>1.6</td>
 
−
                                </tr>
 
−
                                <tr>
 
−
                                    <td>L</td>
 
−
                                    <td>7.7</td>
 
−
                                </tr>
 
−
                                <tr>
 
−
                                    <td>N</td>
 
−
                                    <td>3.6</td>
 
−
                                </tr>
 
−
                                <tr>
 
−
                                    <td>pSB-1C3</td>
 
−
                                    <td>1.6</td>
 
−
                                </tr>
 
−
                            </table>
 
−
                        </div>
 
−
                        <div class="section" id="week-1-day-2-ligation-of-gblock-sequences-with-psb-1c3-backbone">
 
−
                            <h3>Ligation of gBlock Sequences with pSB-1C3 Backbone</h3>
 
−
                            <p>
 
−
                                T4 DNA Ligase was defrosted before use, kept on a freezing block when on the bench, and was the last to be added to the reaction mixture.
 
−
                            </p>
 
−
                            <p>
 
−
                                The 49\(\mu\)L of plasmids were split into seven 7\(\mu\)L portions (~ 125ng / 7 = 18ng), matching up with ~ 50ng of each gBlock to give a desirable vector : insert ratio of almost 1 : 3.
 
−
                            </p>
 
−
                            <p>
 
−
                                The component volumes are:
 
−
                            </p>
 
−
                            <table border="1">
 
−
                                <tr>
 
−
                                    <th>Component</th>
 
−
                                    <th>Volume\(\mu\)l</th>
 
−
                                </tr>
 
−
                                <tr>
 
−
                                    <td>Digested DNA (gBlock)</td>
 
−
                                    <td>29</td>
 
−
                                </tr>
 
−
                                <tr>
 
−
                                    <td>Digested pSB-1C3</td>
 
−
                                    <td>7</td>
 
−
                                </tr>
 
−
                                <tr>
 
−
                                    <td>T4 DNA Ligase Buffer</td>
 
−
                                    <td>5</td>
 
−
                                </tr>
 
−
                                <tr>
 
−
                                    <td>T4 DNA Ligase</td>
 
−
                                    <td>1</td>
 
−
                                </tr>
 
−
                                <tr>
 
−
                                    <td>Milli-Q</td>
 
−
                                    <td>8</td>
 
−
                                </tr>
 
−
                            </table>
 
−
                            <p>
 
−
                                The reaction mixture was incubated at 16℃ overnight.
 
−
                            </p>
 
−
                        </div>
 
−
                        <div class="section" id="week-1-day-2-preparation-of-competent-e.coli-cells">
 
−
                            <p>
 
−
                                A sample of E. coli DH5ɑ stored at -80℃ was defrosted and inoculated in 5mL of LB in a 125mL conical flask (volume of LB 10% of flask volume so as to achieve sufficient aeration). The culture was left to grow overnight at 37℃.
 
−
                            </p>
 
−
                        </div>
 
−
                        <div class="section" id="week-1-day-2-re-pcr-of-dna-sequences">
 
−
                            <p>
 
−
                                Two sets of sequences A,B,F,G, I, J, K, and M were PCRed using the same protocol as 22/06, with one set using a 55℃ annealing temperature and another using 50℃ annealing temperature.
 
−
                            </p>
 
 
                         </div>
 
                         </div>
 
                     </div>
 
                     </div>
 
                 </div>
 
                 </div>
 
             </div>
 
             </div>
−
        </div>
+
            <div class="col-md-3 contents-sidebar">
−
        <div class="col-md-3 contents-sidebar">
+
                <ul id="sidebar" class="nav nav-stacked" data-spy="affix">
−
            <ul id="sidebar" class="nav nav-stacked" data-spy="affix">
+
                    <li>
−
                <li>
+
                        <a href="#cloning">Cloning</a>
−
                    <a href="#week-1">Week 1</a>
+
                        <ul class="nav nav-stacked">
−
                    <ul class="nav nav-stacked">
+
                             <a href="#1">Week 1</a>
−
                        <li>
+
                             <li>
−
                             <a href="#week-1-day-1">Day 1</a>
+
                                 <a href="#1-1">Week 1 - Day 1</a>
−
                             <ul class="nav nav-stacked">
+
                                 <ul class="nav nav-stacked">
−
                                <li><a href="#week-1-day-1-preparation-of-stock-solutions">Preparation of Stock Solutions</a></li>
+
                                    <li><a href="#1-1-prep-stock">Preparation of Stock Solutions</a></li>
−
                                 <li><a href="#week-1-day-1-preparation-of-reaction-solutions">Preparation of Reaction Solutions</a></li>
+
                                    <li><a href="#1-1-prep-reaction">Preparation of Reaction Solutions</a></li>
−
                                <li><a href="#week-1-day-1-polymerase-chain-reaction-set-up">Polymerase Chain Reaction Set-Up</a></li>
+
                                    <li><a href="#1-1-pcr">Polymerase Chain Reaction</a></li>
−
                                 <li><a href="#week-1-day-1-gel-electrophoresis-of-pcr-amplified-gblocks">Gel Electrophoresis PCR-Amplified gBlocks</a></li>
+
                                    <li><a href="#1-1-gel">Gel Electrophoresis of PCR-Amplified gBlocks</a></li>
−
                            </ul>
+
                                 </ul>
−
                        </li>
+
                            </li>
−
                        <li>
+
                        </ul>
−
                            <a href="#week-1-day-2">Day 2</a>
+
                    </li>
−
                            <ul class="nav nav-stacked">
+
                </ul>
−
                                <li><a href="#week-1-day-2-gel-electrophoresis-of-pcr-amplified-gblocks-continued">Gel Electrophoresis of PCR-Amplified gBlocks continued</a></li>
+
             </div>
−
                                <li><a href="#week-1-day-2-visualizing-separated-dna-in-agarose">Visualizing Separated DNA in Agarose - UV Transilluminator</a></li>
+
−
                                <li><a href="#week-1-day-2-extraction-of-dna-pcr-product-from-agarose-gel">Extraction of DNA(PCR product) from Agarose Gel</a></li>
+
−
                                <li><a href="#week-1-day-2-restriction-digest-of-extracted-pcr-product">Restriction Digest of Extracted PCR product</a></li>
+
−
                                <li><a href="#week-1-day-2-restriction-enzyme-digest-of-the-igem-hq-linearised-psb-1c3">Restriction Enzyme Digest of the iGEM HQ linearised pSB-1c3</a></li>
+
−
                                <li><a href="#week-1-day-2-dna-cleanup-using-ezna-enzymatic-reaction-kit">DNA ‘Cleanup’ using EZNA enzymatic reaction kit</a></li>
+
−
                                <li><a href="#week-1-day-2-dna-quantification-using-nanodrop">DNA ‘Cleanup’ using EZNA enzymatic reaction kit</a></li>
+
−
                                <li><a href="#week-1-day-2-ligation-of-gblock-sequences-with-psb-1c3-backbone">Ligation of gBlock Sequences with pSB-1C3 Backbone</a></li>
+
−
                                 <li><a href="#week-1-day-2-preparation-of-competent-e.coli-cells">Preparation of Competent E. coli Cells</a></li>
+
−
                                <li><a href="#week-1-day-2-re-pcr-of-dna-sequences">Re-PCR of DNA Sequences</a></li>
+
−
                            </ul>
+
−
                        </li>
+
−
                    </ul>
+
−
                </li>
+
−
             </ul>
+
 
         </div>
 
         </div>
 
     </div>
 
     </div>
−
</div>
 
 
</html>
 
</html>
  
 
{{:Team:Oxford/Templates/Foot}}
 
{{:Team:Oxford/Templates/Foot}}

Revision as of 09:46, 18 August 2015

Notebook

Cloning

Week 1

Week 1 - Day 1

Preparation of Stock Solutions
  1. gBlocks

    The gBlocks ordered from IDT arrived in the form of vials of 200\(\mu\)g solid DNA powder.

    (refer to BioBricks page for information on DNA sequences)

    The gBlocks were made into 10ng/µl stock solutions in Milli-Q water for storage:

    mass/ng conc/ng\(\mu\)l-1 final volume\(\mu\)l
    200 10 20
  2. Primers

    The forward and reverse primers ordered from IDT came in 32.4nmol and 34.3nmol of solid respectively.

      Sequences
    • Forward - CTTTTTTGCCGGACTGC
    • Reverse - ATGATTTCTGGAATTCGC

The primers were made into 100µM stock solutions in Milli-Q water for storage:

amt/10-9mol conc/10-6M final volume/10-6L
32.4 100 324
34.3 100 343

Preparation of Reaction Solutions

  1. gBlocks

    2\(\mu\)l of each stock solution were diluted in Milli-Q water to achieve final solution volumes of 20\(\mu\)l to make 1ng/\(\mu\)l-1

    2. Primers

    2\(\mu\)l of each stock solution were diluted in Milli-Q water to achieve final solution volumes of 20\(\mu\)l to make 10\(\mu\)M reaction solutions.(The solutions are labelled as "Prefix primer" and "suffix primer" in eppendorf tubes in the fridge)

Polymerase Chain Reaction

25µl reactions were run according to the PCR protocol here

* The final concentrations of the primers were noted as they are needed to determine the annealing temperatures for the primers, which can be done using NEB’s online tool here.

** Add components in order of decreasing volume for maximum ease-of-pipetting.

*** When reaction mixture is being made up, all components as well as the mixture itself are to be kept on ice, as the Master Mix is a high-fidelity polymerase that will recognize the primers as being incorrectly base-paired and be able to hydrolyse the primers if kept at room temperature.

**** Use Q5 enzyme in the cold room to avoid defrosting and freezing the original stock of Q5 enzyme. This could decrease the activity of Q5 enzyme. Bring ice bucket to the cold room to bring Q5 into the bench.

***** Make sure that the primer and small amounts of DNA and primer doesn’t stick onto the side of the tube or the tip.

The reaction mixture tubes were positioned in an Eppendorf Mastercycler nexus X2 and the PCR program was run.

* DNA denaturation can be performed at 98℃ because of the high thermal stability of the Q5 polymerase

** A PCR takes 20-30 seconds to extend a sequence by 1kb, and since our longest sequence is ~2kb the extension time was determined to be 60s per cycle.

Gel Electrophoresis of PCR-Amplified gBlocks

An agarose gel was prepared according to the agarose prepartion protocol.

DNA preparation:

The contents of the PCR tubes need to be stained with a loading dye to help visualize its migration.

To each 25\(\mu\)l of content in each PCR tube, 10\(\mu\)l of blue loading dye was added.