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iGEM Toulouse 2015

Attirer

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L'entrée de la varroase

Le point de départ de la varroase est directement lié à l’entrée du varroa, porté par les abeilles infectées, au sein de la ruche: l’acarien peut ainsi commencer son parasitisme et s’attaquer au couvain. La reine ayant pondu de nouvelles larves d’abeilles au sein des alvéoles, la femelle varroa fécondée va s’y glisser juste avant l’operculation et y pondre ses oeufs. Ces larves vont alors se développer, accentuant l’infection qui touche la population d’abeilles [1]. Afin de palier ce problème, il est nécessaire d’attirer le varroa porté par les abeilles avant que celles-ci ne rentrent pas dans la ruche.

Figure 1 : Cycle de vie du Varroa destructor , d'après B. Alexander

Comment attirer le varroa?

Les larves d’abeille sont productrices d’une large gamme de molécules qui vont avoir un pouvoir attractant sur le parasite et ainsi le pousser à s’y attaquer [2]. Dernièrement, des recherches ont mis en évidence une molécule qui attire significativement le varroa : le butyrate. En effet, il a été prouvé que près de 65% (figure 2) des varroas sont attirés par cette molécule [3].

Le butyrate est un acide très volatile non toxique pour l’abeille ni même pour l’homme car déjà présent à concentrations physiologiques dans le tube digestif. Cette molécule est naturellement produite par des souches telle que Clostridium présentant ainsi tous les pré requis souhaités pour notre projet [4].

Il a donc été décidé de synthétiser du butyrate dans le but d’attirer le varroa.

Figure 2 : Résultats du test d’attraction du butyrate selon la méthode des quadrants

Test de l’attraction du butyrate

Figure 3 : Test d’attraction du butyrate en T avec la présence d’un Varroa au centre

Afin de vérifier les résultats obtenus dans cette étude (Figure 2), un test utilisant un tube en T a été mis au point (Figure 3). Dans l’une des branches se trouve un coton imbibé avec 50 µL d’eau, dans une autre un coton avec 50 µL de butyrate à 4%, et finalement la dernière qui correspond au point de départ du varroa.

Le butyrate étant très volatile, notre système est doté d’une pompe afin de renouveler l’air produisant ainsi un gradient de concentration.

Comment produire de l’acide butyrique chez E.coli ?

Dans le cadre du projet, une souche d’Escherichia coli est utilisée pour sa facilité d’utilisation et son adéquation avec la synthèse d’acide butyrique. En effet, parmi les cinq enzymes constituant la voie du butyrate, deux enzymes sont naturellement présentes chez la bactérie. La voie métabolique suivante a été dessinée:

Figure 4: Schéma de la voie métabolique du butyrate modifiée

Le glucose est le substrat initial dégradé en acétyl-CoA dans de la glycolyse. Finalement, la voie du butyrate a pour point de départ l’acétyl-CoA: nous retrouvons ainsi cinq gènes, dont deux homologues et trois hétérologues.

atoB présent chez E.coli codant pour l’acétyl-CoA acétyltransférase, une acétyltransférase catalysant la condensation de deux acétyl-CoA.

Figure 5: Réaction catalysée par l’acétyl-CoA acétyltransférase
hbd présent chez Clostridium acetobutylicum codant pour la 3-hydroxybutyryl-CoA déshydrogenase, une oxidoréductase catalysant la formation d’une fonction alcool.

Figure 6: Réaction catalysée par la 3-hydroxybutyryl-CoA déshydrogenase
crtprésent chez C.acetobutylicum codant pour la 3-hydroxybutyryl-CoA déshydratase, une lyase clivant les liaisons carbone-oxygène.

Figure 7: Réaction catalysée par la 3-hydroxybutyryl-CoA déshydratase
ccr présent chez Streptomyces collinus codant pour la crotonyl-CoA réductase, une oxidoreductase en agissant sur la double liaison CH=CH. Cette enzyme est également présente chez C.acetobutylicum (bcd: butyryl-CoA dehydrogenase) mais présente l’inconvénient d’utiliser la flavoprotéine de transfert d'électrons (ETF) qui complique la réaction [6].

Figure 8: Réaction catalysée par la crotonyl-CoA réductase
tesB présent chez E.coli codant pour l’acyl-CoA transférase 2, une thiolase qui permet le transfert du coenzyme A.

Figure 9: Réaction catalysée par l’acyl-CoA transférase 2

References

[1] Boecking O, Genersch E. 2008. Varroosis – the Ongoing Crisis in Bee Keeping. J. Verbr. Lebensm. 3:221–228.
[2] Le Conte Y, Arnold G, Trouiller J, Masson C, Chappe B, Ourisson G. 1989. Attraction of the parasitic mite varroa to the drone larvae of honey bees by simple aliphatic esters. Science 245:638–639.
[3] Methods for attracting honey bee parasitic mites. [accessed 2015 Jul 24].
[4] Louis P, Flint HJ. 2009. Diversity, metabolism and microbial ecology of butyrate-producing bacteria from the human large intestine. FEMS Microbiol. Lett. 294:1–8.
[6] Wallace KK, Bao Z-Y, Dai H, Digate R, Schuler G, Speedie MK, Reynolds KA. 1995. Purification of Crotonyl-CoA Reductase from Streptomyces collinus and Cloning, Sequencing and Expression of the Corresponding Gene in Escherichia coli. European Journal of Biochemistry 233:954–962.