Team:Toulouse/project/eradicate fr
Eradiquer
Après avoir attiré puis piégé le Varroa dans un espace confiné à l’entrée de la ruche, il est nécessaire de limiter sa survie et sa possible fuite en tuant le parasite. Il faut savoir que les apiculteurs utilisent déjà des traitements de lutte, parmi lesquels nous retrouvons l’acide oxalique, le fluvalinate, le thymol ou le formate. Tous ces traitements ponctuels utilisent de fortes doses qui sont toxiques pour les abeilles et pour l’homme. D’autre part, le Varroa développe une résistance vis-à-vis de certains de ces traitements les rendant donc inefficaces [1]. Parmi les molécules citées, le formate a fait ses preuves en tant qu’acaricide [2], et présente l’avantage d’être naturellement synthétisé par E. coli. Dans cette partie, l’objectif du projet est donc de faire synthétiser du formate par la bactérie à de faibles concentrations sur une durée de temps réduite afin de réduire les doses et ainsi limiter au maximum la toxicité sur les abeilles.
Test d’efficacité du formate
Avant de pouvoir produire du formate, il a fallu s’assurer de son pouvoir acaricide en mettant au point un test. Trois Varroas sont placés dans une boite de Pétri comportant un coton imbibé de 400 µL de formate à des concentrations variables (50 µM, 500µM, 1mM et 10mM). L’expérience se déroule sur 6h et le parasite est considéré mort dès lors qu’il n’est plus en mouvement même après un stimulus. A noter que le suivi d’observation se fait à l’aide d’une loupe binoculaire.
Les résultats suivants sont obtenus, et un test du khi deux est réalisé afin de déterminer la significativé de notre expérimentation.
Figure 1: Test du pouvoir acaricide du formate
Figure 2: Suivi de la létalité du Varroa en fonction de différentes concentration en formate
(0M, 50µM, 500µM, 1mM, 10mM et 2M)
X-squared = 4; df = 3 ; p-value = 0.2615
Comment produire du formate chez E. coli ?
Le formate est un acide organique simplement obtenu avec E. coli. Le substrat initial, le glucose, est dégradé en pyruvate lors de la glycolyse, puis finalement le formate est synthétisé grâce à deux gènes clés:
- pflB codant pour la pyruvate formate lyase qui catalyse la coupure entre le carbone C1 et C2 du pyruvate. Cette enzyme est sensible à l’oxygène et n’est active qu’en microaérobie ou anaérobie, conditions dans lesquelles la bactérie se trouve au sein du device [3].
- pflA codant pour la pyruvate formate lyase activase qui est indissociable de la pyruvate formate lyase car elle permet son activation [4].
Figure 3 : Réaction enzymatique de la formation du formate
Le formate étant naturellement produit chez E. coli, les gènes nécessaires à sa synthèse sont donc surexprimés. Pour tester la production de formate, les deux gènes cités sont assemblés et mis sous le contrôle d’un promoteur constitutif P(Bla) (BBa_I14018). Un site de fixation des ribosomes (RBS) (BBa_B0030) est ajouté entre chaque gène afin d’améliorer la synthèse protéique, et un terminateur fort (BBa_B1006) représente la fin de la construction génétique, qui est finalement clonée au sein d’un vecteur pSB1C3.
References
- [1] Elzen PJ, Baxter JR, Spivak M, Wilson WT (2000) Control of Varroa jacobsoni Oud. resistant to fluvalinate and amitraz using coumaphos. Apidologie 31: 437–441.
- [2] Satta A, Floris I, Eguaras M, Cabras P, Garau VL, Melis M. 2005. Formic Acid-Based Treatments for Control of Varroa destructor in a Mediterranean Area. Journal of Economic Entomology 98:267–273.
- [3] Becker A, Fritz-Wolf K, Kabsch W, Knappe J, Schultz S, Volker Wagner AF. 1999. Structure and mechanism of the glycyl radical enzyme pyruvate formate-lyase. Nat. Struct. Biol. 6:969–975.
- [4] Crain AV, Broderick JB. 2014. Pyruvate Formate-lyase and Its Activation by Pyruvate Formate-lyase Activating Enzyme. J Biol Chem 289:5723–5729.
