Difference between revisions of "Team:Lethbridge/Notebook September"

 
(2 intermediate revisions by 2 users not shown)
Line 30: Line 30:
 
                             <li><a href="https://2015.igem.org/Team:Lethbridge/Results">Results</a></li>
 
                             <li><a href="https://2015.igem.org/Team:Lethbridge/Results">Results</a></li>
 
                             <li><a href="https://2015.igem.org/Team:Lethbridge/Project_Production">Production</a></li>
 
                             <li><a href="https://2015.igem.org/Team:Lethbridge/Project_Production">Production</a></li>
−
                             <li><a href="https://2015.igem.org/Team:Lethbridge/Project_Judging"></a></li>
+
                             <li><a href="https://2015.igem.org/Team:Lethbridge/Project_Judging">Judging</a></li>
 
                         </ul>
 
                         </ul>
 
                     </li>
 
                     </li>
Line 56: Line 56:
 
                             <li><a href="https://2015.igem.org/Team:Lethbridge/Notebook_September">September</a></li>
 
                             <li><a href="https://2015.igem.org/Team:Lethbridge/Notebook_September">September</a></li>
 
                         </ul>
 
                         </ul>
−
                    </li>
 
−
 
−
                    <li>
 
−
                        <a href="https://2015.igem.org/Team:Lethbridge/Software">Software</a>
 
 
                     </li>
 
                     </li>
 
                     <li>
 
                     <li>
Line 80: Line 76:
 
                 <div class="content_box">
 
                 <div class="content_box">
  
−
                <h1> THIS WILL BE SEPTEMBER </h2>
+
                    <!-- Notebook Entry -->
 +
                    <div class="notebook_entry">
 +
                        <div class="entry_day">
 +
                            <div>1</div>
 +
                        </div>
 +
                        <div class="entry_content">
 +
                            <div class="entry_title">
 +
                                <h1>Ligation, PCR &amp; Digest</h1>
 +
                            </div>
 +
                            <div class="entry_data">
 +
                                <h2>Ligation of High and Low RAP Constructs into PSB1C3</h2>
 +
                                <table>
 +
                                    <tr> <th>Volume (&mu;L)</th> <th>Part                </th> </tr>
 +
                                    <tr> <td>0.5          </td> <td>GBlock              </td> </tr>
 +
                                    <tr> <td>20            </td> <td>Phusion 5x HF buffer</td> </tr>
 +
                                    <tr> <td>2            </td> <td>Biobrick suffix 10nm</td> </tr>
 +
                                    <tr> <td>2            </td> <td>Biobrick prefix 10nm</td> </tr>
 +
                                    <tr> <td>1            </td> <td>phusion polymerase  </td> </tr>
 +
                                    <tr> <td>1            </td> <td>10nm dNTPs          </td> </tr>
 +
                                    <tr> <td>72.5          </td> <td>dH20                </td> </tr>
 +
                                </table>
 +
                                <p>Total volume: 100&mu;L</p>
 +
 
 +
                                <h2>PCR Amplification</h2>
 +
                                <table>
 +
                                    <tr><th>Tempertaure (&deg;C)</th> <th>Time (s)</th></tr>
 +
                                    <tr><td>98                  </td> <td>180    </td></tr>
 +
                                    <tr><td>98                  </td> <td>30      </td></tr>
 +
                                    <tr><td>68.7                </td> <td>30      </td></tr>
 +
                                    <tr><td>72                  </td> <td>45      </td></tr>
 +
                                    <tr><td>72                  </td> <td>300    </td></tr>
 +
                                    <tr><td>4                  </td> <td>Hold    </td></tr>
 +
                                </table>
 +
                                <p>Cycles: 34</p>
 +
 
 +
                                <h2>Digest of RAP constructs with EcoR1 and Pst1: </h2>
 +
                                <table>
 +
                                    <tr>
 +
                                        <th>Volume (&mu;L)</th>
 +
                                        <th>Part</th>
 +
                                    </tr>
 +
                                    <tr>
 +
                                        <td>12</td>
 +
                                        <td>PCR product</td>
 +
                                    </tr>
 +
                                    <tr>
 +
                                        <td>1</td>
 +
                                        <td>EcoR1</td>
 +
                                    </tr>
 +
                                    <tr>
 +
                                        <td>1</td>
 +
                                        <td>Pst1</td>
 +
                                    </tr>
 +
                                    <tr>
 +
                                        <td>2</td>
 +
                                        <td>Cutsmart buffer 10x</td>
 +
                                    </tr>
 +
                                    <tr>
 +
                                        <td>4</td>
 +
                                        <td>dH20</td>
 +
                                    </tr>
 +
                                </table>
 +
                                <p>Total Volume: 20&mu;L</p>
 +
 
 +
                                <h2>Digest of PSB1C3 with EcoR1 and Pst1: </h2>
 +
                                <table>
 +
                                    <tr>
 +
                                        <th>Volume (&mu;L)</th>
 +
                                        <th>Part</th>
 +
                                    </tr>
 +
                                    <tr>
 +
                                        <td>2</td>
 +
                                        <td>PSB1C3</td>
 +
                                    </tr>
 +
                                    <tr>
 +
                                        <td>0.5</td>
 +
                                        <td>EcoR1</td>
 +
                                    </tr>
 +
                                    <tr>
 +
                                        <td>0.5</td>
 +
                                        <td>Pst1</td>
 +
                                    </tr>
 +
                                    <tr>
 +
                                        <td>1</td>
 +
                                        <td>Cutsmart buffer 10x</td>
 +
                                    </tr>
 +
                                    <tr>
 +
                                        <td>6</td>
 +
                                        <td>dH20</td>
 +
                                    </tr>
 +
                                </table>
 +
                                <p>Total Volume: 10&mu;L</p>
 +
 
 +
                                <h2>Ligation of low and high RBS RAP constructs into PSB1C3: </h2>
 +
                                <table>
 +
                                    <tr>
 +
                                        <th>Volume (&mu;L)</th>
 +
                                        <th>Part</th>
 +
                                    </tr>
 +
                                    <tr>
 +
                                        <td>1</td>
 +
                                        <td>PSB1C3 digest</td>
 +
                                    </tr>
 +
                                    <tr>
 +
                                        <td>3</td>
 +
                                        <td>low/high 1 RBS constructs</td>
 +
                                    </tr>
 +
                                    <tr>
 +
                                        <td>1</td>
 +
                                        <td>Ligase 10x buffer</td>
 +
                                    </tr>
 +
                                    <tr>
 +
                                        <td>0.5</td>
 +
                                        <td>ligase</td>
 +
                                    </tr>
 +
                                    <tr>
 +
                                        <td>4.5</td>
 +
                                        <td>dH20</td>
 +
                                    </tr>
 +
                                </table>
 +
                                <p>Total Volume: 10&mu;L</p>
 +
 
 +
                                <h2>Ligation of low and high RBS RAP constructs into PSB1C3: </h2>
 +
                                <table>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <th>Volume (ul)</th>
 +
                                    <th>Part</th>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>1</td>
 +
                                    <td>PSB1C3 digest</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>6</td>
 +
                                    <td>low/high 2 RBS constructs</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>1</td>
 +
                                    <td>Ligase 10x buffer</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>0.5</td>
 +
                                    <td>ligase</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>1.5</td>
 +
                                    <td>dH20</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                </table>
 +
                                <p>Total Volume: 10&mu;L</p>
 +
                            </div>
 +
                            <div class="entry_expand_button">
 +
                                More &darr;
 +
                            </div>
 +
                        </div>
 +
                    </div>
 +
                    <!-- End Notebook Entry -->
 +
 
 +
 
 +
                    <!-- Notebook Entry -->
 +
                    <div class="notebook_entry">
 +
                        <div class="entry_day">
 +
                            <div>2</div>
 +
                        </div>
 +
                        <div class="entry_content">
 +
                            <div class="entry_title">
 +
                                <h1>In Vitro Transcription</h1>
 +
                            </div>
 +
                            <div class="entry_data">
 +
                                <h2>In Vitro Transcription of PCR Products at Varied Conditions</h2>
 +
                                <table>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <th>Volume (&mu;l)</th>
 +
                                    <th>Part</th>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>10</td>
 +
                                    <td>5x TRAB</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>5</td>
 +
                                    <td>DTT 100nM</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>6</td>
 +
                                    <td>NTPs 25nM</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>6</td>
 +
                                    <td>NTPs 25nM</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>2.5</td>
 +
                                    <td>100nM GMP</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>1</td>
 +
                                    <td>0.5units/&mu;L IPPase</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>0.25</td>
 +
                                    <td>40units/&mu;L RNase</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>5</td>
 +
                                    <td>PCR template DNA</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>15.25</td>
 +
                                    <td>milliQ H20</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>5</td>
 +
                                    <td>T7 RNA polymerase</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                </table>
 +
                                <p>Total Volume: 50&mu;L</p>
 +
                                <p>Incubate reactions at 37&deg;C room temp for one hour overnnight.</p>
 +
                                <p>DNase digest for 20 minutes.</p>
 +
 
 +
 
 +
                                <h2>In-vitro transcription time course at 16&deg;C, to observe full length Tt aptazyme</h2>
 +
                                <p>Time points 0, 1, 5, 10, 20, 40, 80 minutes</p>
 +
                                <table>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <th>Volume (&mu;L)</th>
 +
                                    <th>Part</th>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>2</td>
 +
                                    <td>5x TRAB</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>1</td>
 +
                                    <td>DTT 100nM</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>1.2</td>
 +
                                    <td>NTPs 25nM</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>0.5</td>
 +
                                    <td>100nM GMP</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>0.2</td>
 +
                                    <td>0.5units/&mu;L IPPase</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>0.05</td>
 +
                                    <td>40units/&mu;L RNase</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>1</td>
 +
                                    <td>PCR template DNA</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>3.15</td>
 +
                                    <td>milliQ H20</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>1</td>
 +
                                    <td>T7 RNA polymerase</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <p>Total Volume: 10&mu;L</p>
 +
                                </table>
 +
                            </div>
 +
                            <div class="entry_expand_button">
 +
                                More &darr;
 +
                            </div>
 +
                        </div>
 +
                    </div>
 +
                    <!-- End Notebook Entry -->
 +
 
 +
                    <!-- Notebook Entry -->
 +
                    <div class="notebook_entry">
 +
                        <div class="entry_day">
 +
                            <div>6</div>
 +
                        </div>
 +
                        <div class="entry_content">
 +
                            <div class="entry_title">
 +
                                <h1>Overexpression</h1>
 +
                            </div>
 +
                            <div class="entry_data">
 +
                                <h2>Overexpression of RAP Low and High RBS-MS2</h2>
 +
                                <table>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <th>Time Point (hrs)</th>
 +
                                    <th>Optic Density (OD) Low RBS</th>
 +
                                    <th>Optic Density (OD) High RBS</th>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>T1/2</td>
 +
                                    <td>0.8</td>
 +
                                    <td>1.08</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>T1</td>
 +
                                    <td>1.2</td>
 +
                                    <td>1.46</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>T2</td>
 +
                                    <td>1.5</td>
 +
                                    <td>1.89</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>T3 (end)</td>
 +
                                    <td>1.61</td>
 +
                                    <td>1.77</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                </table>
 +
                                <h2>Gels</h2>
 +
                                <table>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <th>Position</th>
 +
                                    <th>content</th>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>1</td>
 +
                                    <td>Tend Low</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>2</td>
 +
                                    <td>T2 Low</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>3</td>
 +
                                    <td>T1 Low</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>4</td>
 +
                                    <td>Ladder</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>5</td>
 +
                                    <td>T<sub>3</sub>0 Low</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>6</td>
 +
                                    <td>T0</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                </table>
 +
                                <table>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <th>Position</th>
 +
                                    <th>Content</th>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>1</td>
 +
                                    <td>Ladder</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>2</td>
 +
                                    <td>T0</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>3</td>
 +
                                    <td>T<sub>3</sub>0 High</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>4</td>
 +
                                    <td>T1 High</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>5</td>
 +
                                    <td>T2 High</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>6</td>
 +
                                    <td>Tend High</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>7</td>
 +
                                    <td>Ladder</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>8</td>
 +
                                    <td>T0 High</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                </table>
 +
                            </div>
 +
                            <div class="entry_expand_button">
 +
                                More &darr;
 +
                            </div>
 +
                        </div>
 +
                    </div>
 +
                    <!-- End Notebook Entry -->
 +
 
 +
                    <!-- Notebook Entry -->
 +
                    <div class="notebook_entry">
 +
                        <div class="entry_day">
 +
                            <div>8</div>
 +
                        </div>
 +
                        <div class="entry_content">
 +
                            <div class="entry_title">
 +
                                <h1>SDS Page</h1>
 +
                            </div>
 +
                            <div class="entry_data">
 +
                                <table>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <th>Position</th>
 +
                                    <th>content</th>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>1</td>
 +
                                    <td>PL</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>2</td>
 +
                                    <td>T0 Low</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>3</td>
 +
                                    <td>T<sub>3</sub>0 Low</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>4</td>
 +
                                    <td>T1 Low</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>5</td>
 +
                                    <td>T2 Low</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>6</td>
 +
                                    <td>Tend Low</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>7</td>
 +
                                    <td>-</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>8</td>
 +
                                    <td>T0 High</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>9</td>
 +
                                    <td> - </td>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>10</td>
 +
                                    <td>T<sub>3</sub>0 High</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>11</td>
 +
                                    <td>T1 High</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>12</td>
 +
                                    <td>T2 High</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>13</td>
 +
                                    <td>Tend High</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>14</td>
 +
                                    <td>PL</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                </table>
 +
                            </div>
 +
                            <div class="entry_expand_button">
 +
                                More &darr;
 +
                            </div>
 +
                        </div>
 +
                    </div>
 +
                    <!-- End Notebook Entry -->
 +
 
 +
                    <!-- Notebook Entry -->
 +
                    <div class="notebook_entry">
 +
                        <div class="entry_day">
 +
                            <div>9</div>
 +
                        </div>
 +
                        <div class="entry_content">
 +
                            <div class="entry_title">
 +
                                <h1>Restriction Digest</h1>
 +
                            </div>
 +
                            <div class="entry_data">
 +
                                <h2> Restriction Digest of PSB1C3 Tt Test RAP High: </h2>
 +
                                <table>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <th>Volume (&mu;L)</th>
 +
                                    <th>Part</th>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>5</td>
 +
                                    <td>PSB1C3 Tt Test RAP high</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>1</td>
 +
                                    <td>EcoR1</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>1</td>
 +
                                    <td>Pst1</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>2</td>
 +
                                    <td>Cutsmart Buffer 10x</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>12</td>
 +
                                    <td>dH<sub>2</sub>0</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                </table>
 +
                                <p>Total Volume: 20&mu;L</p>
 +
                            </div>
 +
                            <div class="entry_expand_button">
 +
                                More &darr;
 +
                            </div>
 +
                        </div>
 +
                    </div>
 +
                    <!-- End Notebook Entry -->
 +
 
 +
                    <!-- Notebook Entry -->
 +
                    <div class="notebook_entry">
 +
                        <div class="entry_day">
 +
                            <div>10</div>
 +
                        </div>
 +
                        <div class="entry_content">
 +
                            <div class="entry_title">
 +
                                <h1>Miniprep</h1>
 +
                            </div>
 +
                            <div class="entry_data">
 +
                                <h2>Miniprep of Tt Test Cultures 1-5:</h2>
 +
                                <ul>
 +
                                  <li>3mL of culture centrifuged at 13,300rpm for 2 minutes; drain supernatent.</li>
 +
                                  <li>Add 100&mu;L solution 1, 200&mu;L solution 2 and 350&mu;L solution 3 in order.</li>
 +
                                  <li>Centrifuge at 13,300rpm for 5 minutes; drain supernatent.</li>
 +
                                  <li>Move supernatent to EZ tube; centrifuge at 10,000rpm for 2 minutes; drain supernatent.</li>
 +
                                  <li>Add 750&mu;L of wash solution, centrifuge at 10,000rpm for 2 minutes; drain supernatent. Repeat.</li>
 +
                                  <li>Transfer column to 1.5mL tube, centrifuge at 10,000rpm for 2 minutes; drain supernatent.</li>
 +
                                  <li>Elute with 50&mu;L warm dH20, centrifuge at 10,000rpm for 2 minutes. </li>
 +
                                </ul>
 +
                            </div>
 +
                            <div class="entry_expand_button">
 +
                                More &darr;
 +
                            </div>
 +
                        </div>
 +
                    </div>
 +
                    <!-- End Notebook Entry -->
 +
 
 +
                    <!-- Notebook Entry -->
 +
                    <div class="notebook_entry">
 +
                        <div class="entry_day">
 +
                            <div>13</div>
 +
                        </div>
 +
                        <div class="entry_content">
 +
                            <div class="entry_title">
 +
                                <h1>PCR</h1>
 +
                            </div>
 +
                            <div class="entry_data">
 +
                                <h2> Diagnostic PCR of Tt Test and RAP High RBS</h2>
 +
                                <table>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <th>Volume (&mu;L)</th>
 +
                                    <th>Part</th>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>5</td>
 +
                                    <td>Quanta AccuStart Supermix 2x</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>1</td>
 +
                                    <td>Plasmid DNA colony suspension</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>0.5</td>
 +
                                    <td>BB prefix T7 promoter</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>0.5</td>
 +
                                    <td>BB suffix primer</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                  <tr>
 +
                                    <td>3</td>
 +
                                    <td>dH<sub>2</sub>0</td>
 +
                                  </tr>
 +
                                </table>
 +
                                <p>Total Volume: 10&mu;L</p>
 +
                            </div>
 +
                            <div class="entry_expand_button">
 +
                                More &darr;
 +
                            </div>
 +
                        </div>
 +
                    </div>
 +
                    <!-- End Notebook Entry -->
 
                      
 
                      
  

Latest revision as of 00:04, 19 September 2015

iGEM

1

Ligation, PCR & Digest

Ligation of High and Low RAP Constructs into PSB1C3

Volume (μL) Part
0.5 GBlock
20 Phusion 5x HF buffer
2 Biobrick suffix 10nm
2 Biobrick prefix 10nm
1 phusion polymerase
1 10nm dNTPs
72.5 dH20

Total volume: 100μL

PCR Amplification

Tempertaure (°C) Time (s)
98 180
98 30
68.7 30
72 45
72 300
4 Hold

Cycles: 34

Digest of RAP constructs with EcoR1 and Pst1:

Volume (μL) Part
12 PCR product
1 EcoR1
1 Pst1
2 Cutsmart buffer 10x
4 dH20

Total Volume: 20μL

Digest of PSB1C3 with EcoR1 and Pst1:

Volume (μL) Part
2 PSB1C3
0.5 EcoR1
0.5 Pst1
1 Cutsmart buffer 10x
6 dH20

Total Volume: 10μL

Ligation of low and high RBS RAP constructs into PSB1C3:

Volume (μL) Part
1 PSB1C3 digest
3 low/high 1 RBS constructs
1 Ligase 10x buffer
0.5 ligase
4.5 dH20

Total Volume: 10μL

Ligation of low and high RBS RAP constructs into PSB1C3:

Volume (ul) Part
1 PSB1C3 digest
6 low/high 2 RBS constructs
1 Ligase 10x buffer
0.5 ligase
1.5 dH20

Total Volume: 10μL

More ↓
2

In Vitro Transcription

In Vitro Transcription of PCR Products at Varied Conditions

Volume (μl) Part
10 5x TRAB
5 DTT 100nM
6 NTPs 25nM
6 NTPs 25nM
2.5 100nM GMP
1 0.5units/μL IPPase
0.25 40units/μL RNase
5 PCR template DNA
15.25 milliQ H20
5 T7 RNA polymerase

Total Volume: 50μL

Incubate reactions at 37°C room temp for one hour overnnight.

DNase digest for 20 minutes.

In-vitro transcription time course at 16°C, to observe full length Tt aptazyme

Time points 0, 1, 5, 10, 20, 40, 80 minutes

Total Volume: 10μL

Volume (μL) Part
2 5x TRAB
1 DTT 100nM
1.2 NTPs 25nM
0.5 100nM GMP
0.2 0.5units/μL IPPase
0.05 40units/μL RNase
1 PCR template DNA
3.15 milliQ H20
1 T7 RNA polymerase
More ↓
6

Overexpression

Overexpression of RAP Low and High RBS-MS2

Time Point (hrs) Optic Density (OD) Low RBS Optic Density (OD) High RBS
T1/2 0.8 1.08
T1 1.2 1.46
T2 1.5 1.89
T3 (end) 1.61 1.77

Gels

Position content
1 Tend Low
2 T2 Low
3 T1 Low
4 Ladder
5 T30 Low
6 T0
Position Content
1 Ladder
2 T0
3 T30 High
4 T1 High
5 T2 High
6 Tend High
7 Ladder
8 T0 High
More ↓
8

SDS Page

Position content
1 PL
2 T0 Low
3 T30 Low
4 T1 Low
5 T2 Low
6 Tend Low
7 -
8 T0 High
9 -
10 T30 High
11 T1 High
12 T2 High
13 Tend High
14 PL
More ↓
9

Restriction Digest

Restriction Digest of PSB1C3 Tt Test RAP High:

Volume (μL) Part
5 PSB1C3 Tt Test RAP high
1 EcoR1
1 Pst1
2 Cutsmart Buffer 10x
12 dH20

Total Volume: 20μL

More ↓
10

Miniprep

Miniprep of Tt Test Cultures 1-5:

  • 3mL of culture centrifuged at 13,300rpm for 2 minutes; drain supernatent.
  • Add 100μL solution 1, 200μL solution 2 and 350μL solution 3 in order.
  • Centrifuge at 13,300rpm for 5 minutes; drain supernatent.
  • Move supernatent to EZ tube; centrifuge at 10,000rpm for 2 minutes; drain supernatent.
  • Add 750μL of wash solution, centrifuge at 10,000rpm for 2 minutes; drain supernatent. Repeat.
  • Transfer column to 1.5mL tube, centrifuge at 10,000rpm for 2 minutes; drain supernatent.
  • Elute with 50μL warm dH20, centrifuge at 10,000rpm for 2 minutes.
More ↓
13

PCR

Diagnostic PCR of Tt Test and RAP High RBS

Volume (μL) Part
5 Quanta AccuStart Supermix 2x
1 Plasmid DNA colony suspension
0.5 BB prefix T7 promoter
0.5 BB suffix primer
3 dH20

Total Volume: 10μL

More ↓